Способ выделения гексокиназы из пекарских дрожжей

ццоиьФ Я:-"А-Н О ПИЗОБРЕТЕНИЯ Союз Советских Социалистических Республик(22) Заявлено 091178 (21) 2681634/23-04с присоединением заявки Мо(51) М. Кл. С 07 С 7/02 Государственный комитет СССР по делам изобретений и открытийДата опубликования описания 15,10,80 И.А.Алишевиченет Г.-К.К.Купятис, И.-Г.И.Песлякас, В.С.Веса и А.-С.А.Глемжа(54) СПОСОБ ВЫДЕЛЕНИЯ ГЕКСОКИНАЗЫ ИЗ ПЕКАРСКИХ ДРОЖЖЕЙИзобретение относится к области энзимологии и предназначается для создания препаративного способа выделения дрожжевой гексокиназы, используемой в качестве важного аналитического реактива .для определения содержания аденозинтрифосфата, глюкозы и других гексоз в биологических жидкостях в медицинской и научной практике.Известные до настоящего времени способы выделения и очистки гексокиназы включают ряд стадий классического выделения и очистки фермента. При этом многостадийность процесса выделения фермента нежелательно сказывается на его выходе, а сам процесс является трудоемким, требующим длительного времени.Известен способ выделения дрожжевой гексокиназы путем биоаффинной хроматографии с использованием сорбента, полученного на основе агарозы и производного никотинамидадениндинуклеотида. Однако данный тип сорбента является непригодным для препаративного выделения гексокиназы иэ-за дороговизны, сложности его получения и низкой стабильности в процессе использования Г 1 . 2Известен также способ выделениядрожжевой гексокиназы, включающийстадии автолиза высушенных пекарских дрожжей в 0,2 М йафР 04 в течение 5 2 ч, центрифугирования и ингибирования дрожжевых протеаз Фенилметилсульфофторидом, их отделения, кислотного фракционирования при рН 4,4с последующим двухкратным фракциони рованием сульфатом аммония нри степенях насыщения 40 и 55 и диализаферментного раствора против ацетатного (рН 4,4) и сукцинатного (рН 6,0буферных раствОров в течение 100 ч, 2,Однако данный способ выделениягексокиназы обладает рядом существенных недостатков:-Процесс выделения целевого фермента является многостадийным, включающим многократные операции центрифугирования и продолжительногодиализа. Технологически при выделении препаративных количеств фермента данные методические приемы, 25 особенно диализ, являются крайненеудобными и трудноосуществимымина практике;Степень очистки выделенногоФермента поставляет всего лишь 5 раэ З 0 при низком выходе (30-35) активногофермента уже на начальных стадияхего выделения, что обуславливаеткрайне низкий выход фермента на последующих стадиях его доочистки.Целью изобретения является повышение выхода фермента и сокращечиепроцесса его выделения.Поставленная цель достигаетсяописываемым способом получения гексокинаэы из пекарских дрожжей,включающим автолиз высушенных дрожжей в 0,2 М йа 2 НРО, отделение авто- флизата, ингибирование протеаз вавтолизате обработкой Фенилметилсульфофторидом и их отделение, хроматографию полученного в результате автолиэата в Ба-Фосфатном буфере рН 7,0- 157,5 на сорбенте,представляющем собойаминоэтилцеллюлоэу,модифицированнуюВ-О-глюкозой в степени 50-70 отначальной концентрации аминогрупп,с последующей десорбцией фермента 2 Оградиентом йа 01 в концентрации 0,051,0 М в исходном буфере.Существенными отличиями,описываемого способа являются осуществлениехроматографии автолизата после от- дделения протеаз в буферном растворефосфата натрия рН 7,0-7,5 с десорбцией Фермента градиентом НаС 1 в кон.центрации 0,05-1,0 М в исходном буФере, а также использование в качестве сорбента аминоэтилцеллюлозы,модифицированной В-О-глюкоэой в степени 50-70 от начальной концентрации аминогрупп,Описываемый способ выделения дрожжевой гексокиназы обеспечивает посравнению с существующими способамиследующие преимущества,"повышение в 2-3 раза выходаактивного фермента, что приводит кснижению себестоимости целевого продукта,двукратное повышение удельнойактивности выделяемого Фермента, чтопривоцит к снижению затрат на дальнейшие стадии доочистки Фермента,сокращение времени процесса выделения Фермента в два раза, чтоважно при получении препаративныхколичеств Ферментов в промышленныхмасштабах. 50 Преимуществом описываемого способа является также то, что исключаются те стадии очистки Фермента, которые обуславливают низкий выход фермента, так как по своей сущности они дейстуют на нативную структуру фермента, разрушая его.П р и м е р 1, Способ выделения дрожжевой гексокинаэы.Пекарские дрожжи измельчают, высушивают в течение 14 сут, при комнатной температуре. 1,87 г высушенных дрожжей суспендируют в 5,6 мл 0,2 М МаНРО 4 и автолиэируют при 370 С в течение 2 ч. Полученный экст ракт центрифугируют при 14000 об/минв течение 20 мин и ингибируют протеазы прибавлением. 0,09 мл 0,04 Мраствора фенилметилсульфофторида в96-ном этиловом спирте. Полученныйэкстракт подогревают до 25 СС и оставляют при этой температуре на 30 минДиализ экстракта проводят против0,005 М натрийфосфатного буфера рН7,5 в течение 36 ч, Концентрациябелка 25 мг/мл, удельная активность3 ед/мг.5 г сорбента загружают в хроматографическую колонку (1,5 х 20 см),уравновешивают 0,005 М натрийфосфатным буфером рН 7,5 и наносят 6,0 млполученного ферментного раствора.Концентрация белка 25 мг/мл, удельная активность 3 ед/мг; При элюции200 мл исходного буферного растворарН 7,5 вымываются балластные белки икрасящие вещества. Элюирование гексокиназы проводят градиентом хлористого натрия от 0,05-1 М в том жебуфере, рН 7,5. Удельная активностьгексокиназы после элюции 38 ед/мг.Выход по активности не ниже 70.П р и м е р 2. Получение сорбента.5 г аминоэтилцеллюлозы ТУН 117-67производства Олайнского завода химических реактивов, аналитической емкостью 0,26-0,45 мг-экв/г суспендируют в 1000 мл дистиллированной водыи через 30 мин жидкость с неосевшимимелкими частицами сливают. Процедуруповторяют 4-5 раэ. Затем влажную массу суспендируют в 1000 мл 0,3 М раствора гидроокиси натрия. Через 1 чжидкость с неосевшими частицами сливают, в дальнейшем декантируют водойдо нейтральной реакции по лакмусу.Отмытую аминоэтилцеллюлозу суспендируют в 250 мл воды и переносят втрехгорлую круглодонную колбу емкостью 500 мл, снабженную механическоймешалкой и обратным холодильником.Добавляют 0,25 г хлористого цинкаи 5 г В-глюкозы и кипятят при перемешивании в течение 7 ч. Затем реакционную массу охлаждают до комнатной температуры, переносят содержимое колбы в однолитровый стакан, инепрореагированную глюкозу и хлористый цинк иэ сорбента удаляют декантацией с водой. Полученный сорбентхранят во влажном состоянии залитымводой в холодильнике при 40 С,Формула изобретенияСпособ выделения гексокинаэы из пекарских дрожжей, включающий автолиэ высушенных дрожжей в 0,2 М НаНР, отделение автолиэата,ингибирование протеаз в автолизате обработкой Фенилметилсульфофторидом и их отделение, от л и ч а ю щ и й с я тем, что, с целью повышения выхода целевого продукта и сокращения про771112 Составитель О. СкородумоваРедактор Л. Емельянова Техред Е, Гаврилешко КорректоР И. Муска Заказ 7394/34 Тираж 495 Подписное ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж, Раушская наб., д. 4 Г 5Филиал ЧПП "Патент", г. Ужгород, ул, Проектная, 4 цесса его выделения, полученный после отделения протеаз автолизат подвергают хроматографии в йа-Фосфатном буфере рН 7,0-7,5 на сорбенте - аминоэтилцеллюлозе модифицированной 8-0-глюкозой в степени 50-70 от начальной концентрации аминогрупп, с десорбцией Фермента градиентом йаС в концентрации 0,05-1,0 М в исходном буфере.Источники информации, принятые во внимание при зкспертизе 1. С.у.ее, 1 Н.1.а 1 агць0.5.КаЬаМоУГ, Р.Я.Вцьье 11, Сг.Н.ачегН,О,Кар 1 ап, АгсЬ. В 1 осЬещ. В 1 орЬуь,178,8, 1977. 2. г;С.Човас.Ь, М.К.Яе 1 сЬ,ч,й 1 е 1 ьоп. 5.Р.Со 1 оыс 1 с. Очисткаи феррологическое сравнение изоферментов дрожжевой гексокиназы Р и Р, АгсЬ. В 1 осЬее. ВорЬув, 158,16 451-457, 1973 (прототип).