Способ получения бактериальной эндонуклеазы 1

ггг 767197 Согоз Советских Социалистических Республик(23) Приоритет- =-Опубликовано 3009,80. Бюллетень Йо 36Дата опубликования описания 300980 С 12 О 13/10 г осударствеииый комитет СССР ио дедам изобретений и открытий(72) Авторы изобретения Б,С.Народицкий, И,М,Грубер, Н.В.Цветкова, И.Э.Семинаи Н.П.Ванеева Московский научно-исследовательский институт вакцини сывороток им. И.И,Мечникова и Институт вирусологииим, Д.И.Ивановского АМН СССР(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ БАКТЕРИАЛЬНОЙ ЭНДОНУКЛЕАЗЫ бог 61 3Изобретение относится к медицинской микробиологии, в частности к способам получения бактериальных Ферментов.Известны способы получения бак териальной эндонуклеаэы Бас 1, в которых так хе как и в предлагаемом изобретении прсгводится получение биомассы, разрушение клеток, выделение активной Фракции, очистка 10 и концентрирование фермента (1.Описанный способ получения Фер" мента отличается, однако, большой трудоемкостью и низким выходом фермента, 15Наиболее близким к предлагаемому по технической сущности являетсяспособ (2, согласно которому штамм 81 гео 1 ощусев асЬцз выращивают на питательной среде, содержащей 1 г/л 20 дрожжевого экстракта, 1 г/л мясного экстракта, 2 г/л триптоэы и 10 г/л глюкозы. Условия подготовки культуры и выращивания авторами не приЮодятся, Культивирование происходит при 25 32 С, выход биомассы составляет 1,8 г/л, ггля выделения активного препарата используют следующие операцииг 10,5 г влахных клеток сус" пендируют в 20 мл буфера,.содержащего 0,01 М трио-НСС(рН = 7,5), 0,01 Мо -меркаптоэтанола, и подвергаг ют разрушению на ультразвуковом дезинтеграторе 20 раз по 30 с при 0 С. Экстракт центрифугируют при 35 тыс. об/мин в течение 30 мин при +4 С.В суспернатант добавляют МаСс до концентрации 1 М и фракционнруют на колонке с биогелем А. 0,5 п 1 в буФере того же состава. Активность фракций проверяют в реакции фрагментации ЛНК йаг 12, В работе отсут ствуют данные по выходу фермента. Удельная активность препарата составляет 2 мкл/13 ЦНК, т.е. в 1 мл содержится 500 условных единиц активности фермента.Недостатком такого метода является незначительный выход биомассы и низкая удельная активность ферменга . Полученный Фермент не может длительно храниться, а должен быть ис" польэован сразу.Целью изобретения является повигге" ние аКтивности и выхода Фермента.Поставленная цель достигается тем, что культивирование продукта ведут на среде Гауэе при 27-28 о, а полученный Ферментный раствор дополнительно очищают путем хрома767197 Таблица 1 9 серии ичес- условединиц ивностимкл ое коо единисти 5 00 30000 32000 а б а т 7 е е++.+++ итьо нагаемом режим5 О биомассу в сткопления Яабпримесей неслеаз и практ с 65 тографии иа гепарин-сефарозе и диализуют против буфера с 50-нымглйгГерйном, причем в процессаххроматографии фермент стабилизируют глицерином.Полученный фермент строго специфичен, так как Фрагмемтирует,ЦНК Фа гана два участка. Препарат практически свободен от неспецифических эндонуклеаз и экзонуклеазной активности, что было проверено реакциейв агарозном геле с А ДНК и,ДНК плазмиды Со 1 Е 1. Полученные в результатедействия фермента рестрикты имеют . липкие концы и способны лигироваться, Это является дополнительнойхарактеристикой высокой степени очисП р и м е р. Культуру Я 1 гер 1 о-. вусеэ а 1 Ьцз д выращивают на питатель- ной среде следующего состава, г/л: бульон Хоттингера 30 хлористыи натрий 51 пептон 5 глюкоза 10 (среда Гаузе 2) . Посев проводят в 0,5 л колбу в 100 мл среды, культивируют трбесуток на качалке со скоростью 100-120 кач/мин, затем пересевают в пятилитровую бутыль с 2 л среды (на 2 л среды - 100 мл посевной культуры). Культуру выращивают трое суток при тех же условияЪ )культивирования, Температура культивирования 27-28 , Отделение биомассы йроводят центрифугированйем. Ко нечный выход биомассы составляет 37-40 г/л. Выращивание в предлатки препарата и отсутствия в немнеспецифических эндонуклеаз и экэонуклеаэной активности. Характерис.тика Фермента ЯаР 1 приведена в табл,1, в табл. 2 приведейа характериСтикаего стабильности, Удельная активностьпрепарата составляет О, 5 мкл/Ц ДЙК,т.е. 1 мл-препарата содержит 2 тыс.условных единиц активности. Иэ 5 гбиомассы получают 25-30 тыс. Условных единиц активности Фермента10 (см. табл,1). Фермент может хранитьсяв течение б месяцев без измененияего удельной активности (см. табл,2),Способ получения Фермента Яа 0 1 может бить воспроизведен в полупроиз 15. водственных условиях,е позволяет получ адин максимальног 1 без значительныхпецифических эндонук- ически свободной от специфической активности Яа 1 11,Для выделения Фермента Яа 0 1 5 замороженной микробной массы су пендируют в 10 мл буфера, содержащего 1 мМ трис-НС 2, 10 мй Ь - мер" каптоэтанола (рН=7,9 и подвергаю ультразвуковой дезинтеграции на йриборе Фирмы МЯЕ при 12 кгц 10 раз по 30 с. В интервалах между дезйнтеграциями тубус деэинтег ратора охлаждают дистиллированным льдом в течение 1 мин.Заказ 7135/23 Тираж 522 Подписное ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий 113035, Москва, 3-35, Раушская наб., д. 4/5Филиал ЧПП Патентф, г. Ужгород, ул, Проектная, 4 Суспензию центрифугируют в тече" ние 90 мин при 20 тыс. об/мин,Все операции проводят при температуре от 0 до + 4 С, К упернатанту добавляют НаСГдо конечной концентрации 1 М. Затем супернатант наносят на колонку с биогелем А 0,5 п 1 (2,6 70 см), уравновешенную буфером, содержащим 10 мИ тряс-НС 10 мМ(1-меркаптоэтанола и 1 М НаС (РН = 7,4) Скорость нанесения образца и элюции Фракций устанавливают .с помощью перистальтнческого насоса (18 мл/ч) . В пробирки перед сбором Фракций приливают по 500 мкл глицерина для стабилизации фермента. Колонку промывают двумя объемами буфера, собирают Фракции по 5 мл. Каждую фракцию проверяют на наличие в ней специфической эндонуклеазы Яа 0 1 в реакции фрагментации цНК Фага А . Активные Фракции объединяют, днализуют против 3 л буфера, содержащего 20 мИ тряс-НС 1, 7,0 мЧ Ь - меркаптоэтанола 0,5 мМ ЕДТА и 0,1 тритона100 (рН 7,4).Диализат наносят на колонку (О, 94 см), заполненную гепаринсефарозой. Скорость элюцин 2,5 ил/ч, фермент Яаб 1 не сорбируется На колонке, он свободно проходят через нее, на колонке остаются балластные белки, что приводит к значительной очистке фермента, Активные фракции объединяют и диализуют против 50 в-ного глицерина, приготов. ленного на буфере, в котором прохо-. дило разрушение микробных клеток, с добавлением в него 0,1 М ЯаСВ. Концентрированные таким образом препараты могут храниться без снижения активности до б месяцев при -20 Использование предлагаемогб способа получения бактериальной эндонуклеазы ЯаГ 1 обеспечивает по сравнению с известными способами следующие преимущества: увеличение вы хода биомассы в 20 раз 1. получениестрого специфичного Фермента беэ заметных примесей неспецифических эндонуклеаз и экзонуклеазной активностиполученный фермент позволяет полу чить фрагменты .ЦНК, способные клигированию предлагаежй методпригоден для полупроизводственного.получения фермента.Формула изобретенияСпособ получения бактериальной35 эндонуклеазы Яа 8 1 из Мгеойочусева 6 Ьця, предусматривающий культивиро"ванне продуцента, ультразвуковуюдезинтеграцию полученной биомассы,.отделение нераэрушеиных клеток цен.33 трифугированием с последующей очисткой центрифугата путем хроматографии на биогеле с получением Ферментного раствора, о т л и ч а ю щ и йс я тем,что,с целью повышенияактивности и выхода фермента, культивирование проруцента ведут на средеГаузе прн 27-28 С.а полученный Ферментный раствор дополнительно очищаютпутем хроматографии на гепарин-се Фарозе и диалнзуют против буфера сф 50-ным глицерином, причем в процес"сах хромотограбии АериЕНт стабилизируют глицерином.Источники информации,принятые во внимание при экспертиэе33 1. фо 1 ЬЬез С. ф 3 опгпаВ о 1 Ч 1-гободу, )977,Ч. 24, Р 2,рр.564579.2,СгопеЬещ 3, Сей ,. 1977,ту, 10, рр.110-111 (прототип).