Способ получения модифицированных ферментов

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ Союз Советскик С оциалистическии Республик(51)м К 3 С 07 6 7/02 А 61 К 37/48 Государствеииый комитет СССР яо делам изобретеиий и открытий(И) УДК 577 15 ,07 (088,8) Дата опубликования описания 300980Казанский ордена Трудового Красного Знамени государственный университет им. В. И. Ульянова-Ленина(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ МОДИФИЦИРОВАННЫХ ФЕРМЕНТОВ1 О Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для получения ферментов, модифициро- ванных как растворимыми (мономерными или включенными в состав полиме= ров),так и нерастворимыми солями диазония, в частности для получения ферментов, связанных с растворимыми носителями и иммобилиэованных при помощи реакции аэосочетания. Иммобилизованные ферменты могут быть использованы в качестве катализаторов в химической промышленности в реакторах проточного типа, а ферменты, связанные с растворимыми носителями 15 помимо использования в качестве ка- тализаторов в химической промышленности, могут найти применение как биологически активные вещества и лекарственные препараты,в -" -20Кроме того, изобретение может быть использовано для изменения физико-химических свойств Ферментов пу" тем их модификации мономерными солями диазония.25Известно множество примеров модификации ферментов ковалентным связыванием с растворимыми и нерастЫоримыми носителями(матрицами) С этой целью особенно широко используют способы ковалентного связывания ферментов с различными носителями при помощи реакций ацилирования (алкилирования), при помощи изоцианатных (изоцианатных) групп, галоидциана, цианурхлорида и его производных или реакции азосочетания;Указанные способы характеризуются тем, что связывание Фермента с носителем осуществляется практически всегда через аминогруппу диаминомонокарбоновых аминокислот. Исключение составляет метод азосочетания, используя который можно осуществить связывание через амино-, сульфгидрильные, циклические и гетероциклические группы аминокислот. Эта особенность реакции азосочетания дает возможность осуществлять связывание Ферментов через значительно большее количество точек, по сравнению со способами, в основе которых лежат узко специфические реакции на аминогруппы белков. Многоточечность связывания, как известно, положительно коррелирует со стабильностью связанных Ферментов 1Недостатком метода азосочетания является его, во многих случаях, низкая эффективность, определяем(носителем) фермента.наи олее стабильныхх и, следовательно,экономически наиболее выгодных.Известен также способ Модификации Пфй тов путем аимо йр и,м е 1. Полследних с солде ствия по- леазы модифицированной 4-В-оксилью диазония на основе этилсульфониланизолп-аминобензилцеллюлозы Г 2ланизолдекстраном. 175 мг4-В-оксиэтилсульфониланизолдекстранапосо осуществляется обработкойрастворяют в 2 мл 0 5 н Н 1- азотнбй кислотой (или растворомф . мл , н НС 1 охлажйа МО в НС 1.) аминобензилцеллюлоэу йай 0 . иаэотидают до 0-2 С и добавляют 6 мпревращают в соль диазонияйай 0. Диаэотируют 5 мин, подщелачидобавляют растворенный в буфере фермент,ия, к которой вают 3,5 н Ма 0 Н до Н 4 0р , и к диаэоПосле переме шивания и удаления из фф 10 мг панк ее ермент, тированному декстрану добавляютсуспенэии путем ее промыпромывания не аствмг панкреатической рибонуклеазы,модифицированно (го не связавшегося с трис-НС 1 Н 8 5. Смер оренной в 1 мл 0,4 М буферасолью диазония) фермента определяр , . Смесь оставляютвыход конечного проду Вляют на 14-1 ь ч.кта. ыход мо- отделяют от о кта еНесвязнвый ферментдифицированной рибонуклеазы и 35трипсина составляет 2,3 и 3,4 соы и химо. помо и гельщ фильтрации на сефадексеОв системе 0,2 М МаСВНедостаток способа - низкий выход , Выхо мо и и ицелевого продукта.ыход модифицированной рибонуклеазы по белку 88, по активности 30.Цель изобретения - увеличениевыхода целевого продукта.В качестве контроля модифика ию20 Р д Фикациюрибонуклеазы проводят м-аминобенУказанная цель досТигается тем,зилоксиметилдекстраном, не со ечто в способе получения модифи и ом, не содерф ц р - жащим заместителей. Выход модифицированных ферментов путем вэаимодейст- ванного фермента по белку 20, поактивности 8-10.вия их с солями диазония, в качестве последних используют диазотированные ароматические амины, содержащи " Р и м е Р 2. ПолУчение рибонуклеэлектроноакцепторную группу 5 0 . - .г 1 воьць модифицированнойих эфиры с дектраном.или 4-В-оксиэтилс ульфониланизолдекстраном.В качестве ароматических аминовВ качестве азосоставляющей испольсодержащих 50 - группу, обычно исполь-ЗОаминов. зуют рибонуклеаз Асс,газу сс,г 1 воьцв. Условиязуют 4 -В-оксиэтилсульфониланизолосвязывания и соотношеения реактивоввый или 4-В-оксиэтилсульфонилаиилиноте же, что и в и иримере 1. Выход конечного продукта 68.вйй спирт, или их эфиры с дектраном,или М - аминобензилсульфонилоксиметилВ качестве конт оля ир роводят модекстран.дификацию рибонуклеазы Асс.г 1 аоцяДля модификации фермейтов исполь 5 Яс- аминобензилоксимети екстлд кстраном,зуют, например 4-В-оксиэтилсульфонилне содержащим заместителей.е . ВыходанизОлдекстран который обрабат, У авляет 28.конечного прод кта состраствором МаМО и НС и и 0 - 2П р и м е р 3. Получение химотрипК полученной таким образо2при - С, сина, мо ифи ид Ф ц рованного 4-В-оксиа м соли диа р этилсульфониланизолдекст анозония декстрана после доведения Нр до 105 мг 4-В-о3-4 добавляют фермент в буфере и-В-оксйэтилсульФониланизолоставляют на 14-16 ч. МодиФицировандекстрана растворяют в 2 млные ферменты отделяют от немод фициНС 1, охлаждают до 0-2 оС ированных любым доступныМ методом4 мг МаМО, Диазоти ют 54 з; Д "румин, подще(гельфильтрацией, ионным обменом и 4 элачивают 3,5 н МаОН о Н 4д Р,Оикт. д.),диазотированному декстрану добавляМодиФикация ферментов соляи и з - Р , Растворенногоют 10 мг хймоТрипсинааствония на основе 4-В-оксиэтилсульфонилд азо- в 1 мл 0,4 М б фе а т4 оси и. Смесь оставляют на 14-16фониланилинового р фе фер ент отделяют от продукта Реэфиров сдекстраном увеличивает - кции Р помощи гельфильтрации наход модифицированных ферментов по ефадексе - 5 в системе 0,2 М йаС 1,белку в 4,4 раза, по активности вП р и м е р 4. Получение панкре 3-3,5 раза.и в атической рибонуклеазы, модифицированной солью диазония на основе 4-8 Это увеличивает эффективность-оксиэтилсуЛьФониланизолового спирта.связывания ферментов с носителями 4 мл 4-В-оксиэтилсульфониланизолопри помощи азосочетания. увеличение вого спирта диазотируют, как указановыхода связанных ферментов дает воэ- в примере.1, затем приливают 2 млможйость широко. использовать этот 0,2 М трио-НС буфера РН 8,5, в кот- способ вместометодов ковалентного 49 Ром раствоРено 5 мг рибонуклеазы.связывания, основанных на узкоспецифических реакциях. При этом с больщим В качестве контроля проводят мовыходом-возможно получение Фермейтов, дификацию рибонуклеазы м-аминобензил"- связанных с"носителем наибольшим оксиметиловым спиртом, не содержацимколичеством"точек свяэйвания, т. е. у заместителей.787120 Составитель О. СкородумоваРедактор М. Недолуженко Техред А.Щепанская Корректор С. Щомак Заказ,6971/10 Тираж 495 ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий 113035, Москва- Ж, Раушская наб., д. 4/5Подписное филиал ППП "Патентф, г. Ужгород, ул. Проектная,41 Выход модифицированной рибонуклеазы, по сравнению с контролем, увеличивается в 3-4 раза.П р и м е р.5. Получение панкреатической рибонуклеазы, модифицированной солью диазония на основе 4-оксиэтилсульфониланилинового эфирадекстрана.175 мг 4- 8 -оксиэтилсульфониланилннового эфира декстрана диазотируют, как указано в примере 1, добавляют 10 мг рибонуклеазы, растворенной в 1 мл 0,4 М трис-НС 1 буФера рН8,5. Смесь оставляют на ночь. Несвязанный фермент отделяют от продуктов .реакции гельфильтрацией на сефадексе ч -75 в системе 0,2 М йаС 15Выход модифицированного ферментапо белку 80, по активности 27.П р и м е р б, Получение панкреатической рибонуклеазы, модифицированной солью диазония на основе 4- 8 - 2 Ооксиэтилсульфониланилинового спирта.,4 мг 4-8 -оксиэтилсульфониланилиновогоспирта диазотируют, как описано впримере 1, приливают 2 мл 0,2 М трис-НС 1 буфера рН 8,5, в котором растворено 5 мг рибонуклеазы.25В качестве контроля проводят модификацию риббнуклеазы, м-аминобензилоксиметиловым спиртом.Выход модифицированной рибонуклеазы по сравнению с контролем увеличивается в 3-4 раза,П р и м е р 7. Модификация панкреатической РНК-азы м-аминобензилсульфонилоксиметилдекстраном. В качестве азосоставляющей используют 35панкреатическую РНК"азу, в качестведиазосоставляющей-м-аминобензилсульфонилоксиметилдекстран. Условиямодификации и соотношения реактивов те же, что и в примере 1 Выход конечного продукта по белку 80, по активности 30.В качестве контроля, модификацию РНК-азы проводят м-аминобензилоксиметилдекстраном, не содержащим группу 5 ОВыход модифицированного фермента по белку 20, по активности 8-10. Формула изобретения1. Способ получения модифицированных ферментов, включающий взаимодействие ферментов с солями диазония, б т л и ч а ю щ и й с я тем,что, с целью увеличения выхода целевого продукта, в качестве солей диазония применяют диазотированные ароматические амины, содержащие электроноакцепторную группу 50 или нх эфирыс декстраном.2. Способ по и. 1, о т л и ч а ющ и й с я тем, что в качестве ароматических аминов, содержащих 50группу, используют 4-В-оксиэтилсульфониланизоловый или 4-6-окснэтил-сульфониланилиновый спирт, или ихэфиры с декстраном, или м-аминобензилсульфонилоксиметилдекстран.Источники информации,принятые во внимание при экспертизе1. Иммобилизованные ферменты.Сборник Под ред. Березина И. В.Антонова В. К., Мартинека К. МГУ,1975, т. 1.2.И 1 йг И,А. 5 иаеага 1 А,5 упФЬеыь оГ Ьо 1 оса 11 у ас 1 чесе 11 цове .Ьег 1 часчеь о 1 епгуееь,