Способ получения над-зависимой алкогольдегидрогеназы

Союз СоветскихСоциалистическихРеспублик ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ(22) Заявлено 070678 (21) 2626246/28-13с присоединением заявни МВ -(5)М, Кл,Д С 12 0 13/10 Государственный комитет СССР но делам изобретений и открытий(72) Авторы изобретения Московский ордена Ленина и ордена ТрудовогоКрасного Знамени государственный униаерситетим, М, В, Ломоносов а(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ НАД-ЭАВИСИМОЙ АЛКОГОЛЬДЕГИДРОГЕНАЗЫ Изобретение относится к микробиоилогической промышленности, а именно, к способам получения НАД-зависимой алкогольдегидрогеназы из дрожжей. 5Изобретение может найти прнменениев фармацевтической и медицинской промышленности, а также в научных исследованиях.В последние годы было показано,что НАД-зависимая алкогольдегидрогенаэа из печени человека, лошади и пекарских дрожжей обладает широкой субстратной специфичностью и катализирует наряду с окислением этанола иокисление метанола,Способна окислять метанол и НАД-зависимая дегидрогеназа иэ метанолокисляющих дрожжей ЦОднако активность по метанолу НАДОзависимой алкогольдегидрогеназы иэназванных источников очень низка. Получение НАД-зависимой алкогольдегидрогенаэы с высокой активностью по метанолу имеет, кроме чисто науч ного, также практическое значение, Окисление метанола с помощью НАД-зависимой алкогольдегидрогенаэы может найти применение в процессах, в коррых необходима регенерация кофак" 30 2тора, а именно НАДН, Это многие биохимические окислительные процессы, например получение аминокислот, модификация стероидов и т.д. Перспективным является также создание биоэлектрохииических систем окисления различных органических соединений для создания топливных элементов, в которых НАДН выполнял бы роль переносчика электронов с органических соединений на электрод.Наиболее близким к изобретению является способ получения НАД-зави- симой алкогольдегидрогеназы иэ дрожжей Р 1 сЫа раппе, предусматривающий культивирование дрожжей при аэрации в периодическом режиме на синтетической питательной среде, содержащей источники азота, фосфора, минеральные ссди и 2 метилового спирта в качестве источника углерода, а также выделение, фермента (21,Недостатки способа: низкая активность фермента по отношению к метанолу, составляющая 402 нмоль/мг белка мин периодические условия культивирования, которые не позволяют поддерживать культуру в одном и том же физиологическом состоянии с высокой ферментативной активностью;, утрименение в качестве источника углерода метилового спирта усложняет культивирование в промышленных масштабах, так как он летуч и токсичен. Вэтом случае необходима очистка сточных вод от метанола,5Цель изобретения - повышениеметанолокисляюцей активности Ферментаи эффективности процесса,Ук аз анная цель достигае тся тем,что в качестве продуцента используютдрожжи Сапс 11 с 1 а юеЮу 11 са ИБФМ У,а культивирование ведут в проточныхусловиях, при этом в качестве источника углерода используют этиловыйспирт в концентрации 0,01-0,1 об 15Повышение эффективности процессапроисходит за счет того, что культивирование в условиях протока позволяет получать большие количества биомассы, а также поддерживать культуру 20в одной и той же фазе роста при постоянной концентрации источника углерода в среде, что является необходимым условием для получения фермента с высокой метанолокисляющей 25активностью, Эффективность процессаповышается и за счет использованияв качестве источника углерода этилового спирта, что упрощает технологию, ЗОСпос об ос ущес твл яют следующим образом,Дрожжи СапЖЙа ве 1 Ьу 21 са ИБФМ -.670 культивируют на синтетическойпитательной среде следующего состава:(ИН 4)2 НРО 4 0,5 г/л; ИН 4 Н 2 РО 4.1,5 г/л; КБОб 4,0 г/л; М 9804 0,25 г/л,дрожжевой автолизат 0,01 г/л, этиловый спирт 0,01-0,1 об, , Культивирование проводят в ферментере в непрерывно-проточном режиме с коэффициентом разбавления 0,1.-0,05 ч-при аэрации, рН среды 6,0,Для выделения фермента биомассуразрушают путем рас тирания стеклянными бусами и центрифугируют, супер"натант хроматографируют на ДЕАЕ-целлюлозе, Активность полученнсго препарата по метанолу 7100 нм/мг белка мин,П р и м е р 1.В качестве продуценга используют штамм метилотрофныхдрожжей Сапс(вайа щейуй.са ИБФМ У 670,который хранится в коллекции института биохимии и физиологии микро"организмов АН СССР в г.ПУщино-на."Штамм защищен авторским свидетельством Р 449933,кл. С 21 С 11/18,Дрожжи культивируют на минеральной среде следующего состава,г/л:(БН 4) НРО 4 0 5; НН 4 Н 2 РО 4 15; КЮ40; М 9 ЯО 4 0 25; дрожжевой автолизат 0,01. Вода дистиллированная,Значение рН среды доводят солянойкислотой до о,О, Стерилизацию средыпроводят при 1 атм 20 мин. В качестве источника углерода используют эти повый спирт, который добавляют после.терилизации в количестве 0,05 об.Для вырациванМя культуры используют ферментеры фирм 1 КВ (Швеция)или В,Вгацп Ме 1 зцпдег (ФРГ), Культивирование проводят в непрерывно-проточном режиме по хемостатному принципу. Для предотвращения вспенивания в среду добавляют силиконовоемасло (0,01 ), Подача среды осуществляется регулируемыми перистальтическими насосами. Коэффициент разбавления Д=0,1-0,05 ч . Аэрацию проводятвоздухом из расчета один объем в минуту на один объем среды. Скоростьвращения мешалки 400 об/мин, Температура среды культивирования 28 С,оЗначение рН среды поддерживают постоянным (6,0) при автоматической подачещелочи (0,5ИаОН). Рост культурыизмеряют по плотности суспензии,Выходяцую из ферментера суспенозию клеток охлаждают до 2 С и подвергают сепарироваию на суперцентрифуге при 2800 об/мин. Отсепариро-.ванные клетки (20 г) суспендируют в40 мл 0,1 м фссфатного буфера,(КН РО 4- ИаОЙ, рН,5), содержаще 2го 1 мМ дитиотрейтола и разрушаютна СР-дезинтеграторе (Швеция) прискорости вращения мешалки 3000 об/минв течение 25 мин, Гомогенат центрифугируют в течение 1 ч при 4000 у,Супернатант разводят 0,02 М фосфатным буфером с дитиотрейтолом (1 мМ)до 100 мл и используют для ионообменной хроматографии на колонке сДЕАЕ-целлюлозой, уравновешенной темже буфером. Элюирование проводят спомоцью ступенчатого градиента, получаемого добавлением к исходномубуферу БаСХ, Препарат алкогольдегидрогеназы элюируется 0,2 М ИаСХ,В результате,ионообменной хроматографии на ДЕАЕ-целлюлозе получа-ют препарат НАД-зависимой алкогольдегидрогеназы, очищенный в 20 раз иобладающий высокой удельной активностью по метанолу (7100 нм/мгбелка мин),П р .и м е р 2.Дрожжи СапЖс(а ще 1 ЬуЮса ИБФМ Увыращивают согласнопримеру 1, В качестве источника углерода используют этиловый спирт в концентрациии 0,01 об. , После выделения фермента, осуцествленного способом, описанным в примере 1, получаютпрепарат НАД-зависимой алкогольдегидрогеназы, очищенный в 20 раз, сУдельной активностью по метанолу1200 нм/мг белка мин,П р и м е р 3.Дрожжи Сапй 1 ба вейЬуЙса ИБФМ Увыращивают согласно примеру 1. В качестве источникауглерода используют этиловый спиртв концентрации 0,1 об, . После выделения Фермента, осуществленногоспособОм, описанным в примере 1, получают препарат НАД-зависимой алко763464 Составитель,Н.ПаниковРедактор Т, Девятко Техред И.Асталош Корректор С,Шекмар Эаказ .6234/25 Тираж 522 ПодписноеВНИИПИ Государственного комитета СССРпо делам изобретений и открытий1 13035, Москва, Ж, Раушская наб., д.4/5 филиал ППП Патентфф г.Укгород, ул.Проектная, 4 гольдегидрогенаэы, очищенный в 20 раз, с удельной активностью по метанолу 500 нмlмг белка мин,Предлагаеьий способ позволяет получить НАД-зависимую алкогольдегидрогеназу с высокой метанолокисляющей активностью (в 15 раз выше, чем в известном способе), а также повысить эффективность процесса эа счет применения проточных условий культивирования и использования нетоксичного этилового спирта как источника углерода. формула изобретенияСпособ получения НАД-завиеимой . алкогольдегидрогенаэы,предусматривающий культивирование продуцирующих ее дрожжейпри аэрации на синтетической питательной среде, содержащей источники азота, фосфата, минеральные соли и спирт в качестве источника угледора, с последующим выделениемцелевого продукта, о т л и ч а ющ и й с я тем что, с целью повыше"ния метанолокисляющей активности Фермента, в качестве продуцента используют дрожжи СапйЫа вербуй.саИБФМ у, а культивировайие ведутв проточныМ условиях, при этом в качестве источника углерода используют этиловый спирт в концентрации10 0,01-0,1 об. ф.Источники информации,принятые во внимание при экспертизе1, Семискер Я.А Микельсаар С.К.,Хейнару Э,Х, Окисление метанола НАДспецифичной дегидрогеназой метанол-.5 усваивающих дрожжей. - "Микробиология, 19.77., т.46, вып,1, с. 169-171.2,Ме 1 га Н 7, РугЫ 1 пе Нцс 1 еоЫйеЬ 1 пЕей ОхЫаг 1 оп ой щеЖапо 3. 1 п юе 1 апо 1-авз 1 па 11 аЫпу уеазз-,доцгпаХ ой20 Вас 1 ег 1 о 1 оду, 1975, 124, 9 3,1165-1167.