Способ получения дегидрогеназ

Союз Советских Социалистических РеспубликОПИСАНИЕИЗОБРЕТЕНИЯК АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ 1 н 763463(22) Заявлено 260578 (21) 2621686/28-13с присоединением заявки Мо 2653704/28-13(51)м, Кл,3С 12 0 13/10 Государственный комитет СССР по делам изобретений и открытий(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ДЕГИДРОГЕНАЭ Изобретение относится к микробиологической промышленности, а именно, к способу получения дегидрогеназ микробиологическим путем, 5 Известен способ получения дегидрогеназ, предусматривающий культивирование бактерий рода Ряеис 1 ожопая напитательной среде, содержащей источники углерода, азота, фосфора и минеральные соли, дезийтеграцию с последующей обработкой бесклеточногоэкстракта сульфатом стрептомицина,сульфатом аммония и очистку Ферментного препарата (1) .В качестве источника ферментаиспользуют бактерии Ряецйоп 1 опаэпм 11 чогаця, выращенные на среде сглюкозой. Вйход глюкозо-б-фосфат дигидрогеназы 30, активность 140 ед/мгбелка,Известныйспособ 1 тредполагает получение;только одной, а именно, глюкоэо-б-фосфат дегидрогеназы. 25 Недостатками известного способа являются невысокий выход Фермента и использование глюкозы в качестве субстрата для выращивания бактерий30 Цель изобретения - повышение выхода целевого продукта и удешевление,его,Указанная цель достигается тем,что в качестве продуцента используют штамм Ряецботопая о 1 еочогапя52, выращенный на питательной среде,содержащей в качестве источника углерода метанол или метиламин, аочистку Ферментных препаратов проводят Фракционированием на сефадексеСи хроматографированием наДЭЛЕ-агарозе с получением фракций,содержащих глюкозо-б.-фосфат дегидрогеназу и б-фосфоглюконат дегидрогеназу.После хроматографии на ДЭАЭ-агарозефракцию,.содержащую б-фосфоглюконат дегидрогеназу, дополнительно очищают. на колонке с фосфоцеллюлозой,Способ осуществляют следующим образом.Штамм Ряецйощопая о 1 еочогапя 52выращивают в течение 24 ч на питательной среде, содержащей в качествеисточника углерода 2-5 метанола илиметиламина. Клетки отделяют, разрушают с помощью ультразвукового дезинтегратора, белки экстрагируют буферным раствором, Белковый экстракт обрабатывают последовательно сульфатомстрептомицина и сульфатом аммония,Полученный ферментный препарат фракционируют на колонке с сефадексом6"150. Фракцию, содержащую обе дегидрогенаэы, хроматографируют на колонке с ДЭАЭ-агарозой для их разделения, Выход глюкозо-б-фосфат дегидрогеназы 35-40, удельная активность160-170 ед/мг белка,фракцию, содержащую б-фосфоглюко-нат дегидрогеназу, полученную послехроматографирования на ДЭАЭ-агароэе,далее хроматографируют на колонке сфосфоцеллюлозой,Выход б-фосфоглюконат дегидрогеназы 15-20, удельная активность15-17 ед/мг белка,ХарактерИстика штамма Ряецйощопаяо 1 еочогапя 9 52,Штамм выделен из активного ила ихранится в коллекции культур микроорганизмов кафедры микробиологии биологического факультета МГУ,Морфология и культуральные свойства,Грамотрицательные подвижные палочки с одним полярным жгутиком. Средний размер клеток 1,0-1,8 хХ 0,4-0,7 мкм, Колонии на МПА-округлые,гладкие, выпуклые, непрозрачные, белые;при старении приобретают цвет кофе смолоком,до 1 мм в диаметре, края ровные, структура однородная, легко снимаются с агара петлей, Культура обильно растет на МПА, на сусле-агаре иголодном агаре роста нет,Физиология и биохимические свойства.Штамм 9 52 - облигатный аэроб, желатину не разжижает, молоко не пептонизирует; сероводород и аммиак приросте на МПБ не образует; нитраты восстанавливает до нитритов и далее догазообразных продуктов. Оптимальная .отемпература для роста 25-27 С, оптимальное значение рН 7,0-8,0,Штаммрастет на средах с углеводородами(гексадекан) и спиртами (метанол,этанол, пропанол, н-бутанол, изобутанол и глицерин), Иэ органическихкислот рост бактерий обеспечивают:малат, сукцинат, пируват, цитрат, лактат, бенэоат, бутират, Фумарат, гликолат; из углеводов"глюкоза, сахароза, фруктоэа, мальтоза, рамиоэа,галактоэа, ксилоза. Из одноуглеродных соединений Ря,о 1 еочогапя 9 52наряду с метанолом использует метиламин, но не растет на средах с форм"альдегидом, Формиатом, диметиламином и триметиламином, При росте насредах с метанолом,метиламином и другими субстратами образует большоеколичество полисахаридной слизи, Использованиее одноуглеродных соединений Ря.о 1 еочогапя 9 52 осуществляется посредством гексулозофосфатногоцикла (вариант Энтнера"Дудороиа) . П р и м е р 1.Ряецйопюпая о 1 еочогапя 952 выращивают в ферментере с рабочим объемом 70 л на среде следующего состава,(г на 1 л среды):КНРО 42,0МаС 1 0,5; (М 1)ЯО 4 2,0; МуЯО 4 0,025 уГеЯО 4 0,01; метанол 5,0, рН среды до"водят до 7,2 10-ным раствором ИаОН.Температура выращивания -30 С, скорость перемешивания - 600 об/мин,аэрация - 0,5 объема воздуха в минуту на 1 объем среды. После 24 ч культивирования клетки собирают на сепараторе АСГ-ЗМ, Все дальнейшие операции проводят при + 4 С, В качествебуферного раствора используют 20 мМтри с-НС 1, рН 7, 1 содержащий 2; 5 мй15 МЗС 1 и 10 "М дитиоэритритола (буферА). Клетки (100 г) разрушают на ультразвуковом дезинтеграторе МЯЕ(20 кГц Зх 1 мин), белки экстрагируют буфером А и освобождают от кле 20 точных обломков и неразрушенных клеток центрифугированием (20000 д,40 мин) .К экстракту добавляют сульфатстрептомицина до концентрации 1,25 центрифугируют (10000 ц, 20 мин) иосадок отбрасывают,К супернатанту добавляют сульфатаммония до 50-ного насыщения, Осадок отбрасываютферменты осаждают,доводя концентрацию сульфата аммония до 60-ного насыщения, Осадокрастворяют в минимальном объеме буФера А. Нерастворившийся осадок удаляют центрифугированием (200009,15 мин) . Раствор наносят на колонкус Сефаде ксом 6-1 50 ( 25 0 мл ) и элюируют Ферменты буфером А, Фракцииэлюата, содержащие обе дегидрогеназы,наносят на колонку с ДЭАЭ-агарозой,Фракции злюата, содеркащие 6-Фосфо 40 глюконат дегидрогенаэу, диализуютпротив 0,05 М ацетного буфера, рН 5,6, содержащего 10-4 М дитиоэритритолаи наносят на колонку (40 мл) с фосФоцеллюлозой, Фермент элюируют градиентом, концентрации МаС 1 в том жебуФере ( 0-0,4 М). Далее препаратконцентрируют переосаждением сульФатом аммония или на колонке сДЭАЭ-агароэой,К полученным препаратам для стабилизации ферментов прибавляют глице-уин до концентрации 50,Выход глюкозо-фосфат дегидрогенаэы 40, удельная активность170 ед/мг, Выход 6-Фосфоглюконат дегидрогенаэы 20, удельная активность17 ед/мг белка,П р и М е р 2.Способ осуществляютсогласно примеру 1,но в качестве источника углерода используют 5 г/л мед тиламина.Выход Ферментов и их удельнаяактивность соответствуют полученным .в примере 1.Описанный способ позволяет получить в одном процессе глюкозо-фосу Фат дегидрогеназу и б-Фосфоглюконат763463 Формула изобретения Составитель Т.МелентьеваРедактор Г,Девятко Техред И.Асталош Корректор Г,Решетник Эаказ 6234/25 Тираж 522 Подписное ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и откгытий 113035, Москва, й, Раушская наб., д,4/5Филиал ППП Патент, г,ужгород, ул,Проектная, 4 дегидрогенаэу с хорошим выходом ивысокой удельной активностью, а также использовать в качестве субстратов дешевое непищевое сырье взаменглюкозы. 1, Способ получения дегидрогеназ, предусматривающий культивирование бактерий рода Рзецйовопаз на питательной среде, содержащей источники углерода, азота фосфора и минеральные соли, дезинтеграцию с последующей обработкой бесклеточного экстракта сульфатом стрептомицина, сульфатом аммония и очистку ферментного препарата, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что, с целью поведения выхода . целевого продукта и удешевления его, в качестве,продуцента используют штамм Рэецдовопаз о 1 еочогапэ 52, выращенный на питательной среде,содержащей в качестве источника Углеродаметанол или метиламин, а очисткуферментных препаратов проводятфракционированием на сефадекс0-150 и хроматографированием наДЭАЕ-.агароэе с получением фракций,содержащих глюкоза-б-фосфат дегидрогенаэу и б-фосфоглюконат дегидроО геназу2. Способ по п.1, о т л и ч а ющ и й с я тем, что после хроматографии на ДЭАЕ-агароэе фракцию, содержащую б-фосфоглюконат дегидрогеназу, дополнительно очищают на колонке с фосфоцеллюлозой.Источники информации,принятые во внимание при экспертизе1. Чапсег Хук 7,С., Ьезэ 1 е Т.О.ТЬе Лоцгпа 1 ой Вааегхо 1 о 9 у 120.20 1033, 1974 а