Способ получения фракции сывороточного альбумина

о Ыс А:н и е ИЗОБРЕТЕНИЯ 1рщ 736861 Сфюз Соаатскма Сфцмапнстнческна Респубянк) осуяарственнми момиес ГГГР ио лелач мибрегелнй и пткрьютийОпубликован летеиь505,80.вания о а опублик писания 26.05,ИностранцыЛевис Ир и Джэмс Михаел Шук ( Си)А) 72) Авторы изобретен рлс ( Иностранная фирмаМонсанто КомпаниИИ СЫВОРОТОЧНОГО 10 ш п Изобретение относится к м еа именно гематологии,Известен способ получения фракции сывороточного альбумина путемадсорбцин на нерастворимых в водепоперечно, сшитых полиэлектролитныхсополимерах этилена с ангидридоммалеиновой кислоты с содержаниемдополнительных диметиламинопропиловых функциональных групп с последующим элюированием целевого про"дукта (1) .Однако известный способ не обес-,печивает высоких чистоты и выходацелевого продукта (67).Белью изобретения является повыение чистоты и выхода целевогородукта,Это достигается тем, что адсорбцию проводят на сополимере при рН5,0-5,5 и температуре 65-72 С в течение 1-4 ч и затем устанавливаютрН смеси 3,5-4,5.Сывороточный альбумин получаютиз крови, кровяной плазьы, кровянойсыворотки и их фракций, содержащихальбумин, Так как при нагреваниивозможно денатурирование содержащихся в обрабатываемом материале глобу,лииов, то сначала выделяют опрейте" ленные необходимые глобулиновыефракции, как у -глобулины, Другиефракции крови, как факторы свертывания крови, и протромбиновый комп лекс также выделяют иэ плазменногоисходного материала,Нерастворимые в воде поперечносшитые полиэлектролитные сополимеры являются сополимерами этиленас ангидридом малеиновой кислоты ссодержанием дополнительных диметиламинопропиловых функциональныхгрупп, Основной сополимер этиленас ангидридом малейновой кислоты 16 (ЭАМК) получают путем взаимодействия этилена с ангидридом малеиновойкислоты в присутствии катализаторана бснове перйкиси" в "соответствующем растворителе. Основной сополи мер этилена с ангидридом малеиновой кислоты затем подвергают взаимодействию сметилиминобиспро)тиламином, содержащим две первйчные амйновые группы, получая поперечно И сшитый ЭАМЩ-сополимер, Желательныедиметиламинопропиловые функциональные группы могут быть затем добавлены в поперечно сшитый полимер путем взаимодействия диметиламинопро пиламина с ангидридными группами40 ЭАМК-сополимера. Полиэлектропитный сополимер предпочтительно превращают в солянокислую соль для достижения большей технологичности продукта.Предпочтительный полиэлектролитный сополимер содержит около 5 метилаьвнобкспропиламиновых сшивающих групп и около 90 дополнительных диметиламикопропиламиновых Функциональных групп на 100 ед, ангидридамалеиновой кислоты в ЭАМК-сополимере. Полкэлектролитный сополимер способен в Основном полностью адсорбировать Весь альбумин кровяной фракции, после чего альбумин можновыделять с выходом выше 90 с 94-ной 15 чистотой, применяя способ горячей обработки и селективного элюирования.Полиэлектролитные сопалимерысмешивают с кровяной плазмой или сы вороткой, или альбуминсодержащими Фракциями крови, предпочтительно в концентрациях 1-5 сополимера. Регулировкой значения РН смолисто-белковой смеси на разные уровни внача ле удаляют выборочные белки, При РН 5,5-7,5 смолой адсорбируются альбумин, О( и Я-глобулины и фиб риноген, в то время как большая часть у -глобулина остается не поглощенной и может быть выделена из остатка для терапевтических целей. Первоначальное выделение " -глобулина осуществляют при РН 6, Часть поглощенных О( и р -глобулинов и Фибриногена выделяют доведением РН смолисто-белковой смеси примерно дб 4,7 с последующим сбором десорбированного остатка.Значение РН смолисто-белковой смеси затем доводят до 5,0-5,5 с нагревом до температуры примерно 65-72 С в течение 1-4 ч, РН регулируют в пределах 5,2-5,3 с нагреванием смолисто-белковой смеси примерно при 72 аС в течение 1 ч, 45При осуществлении стадии горячей обработки остаточные глобулины, в основном Ю и р глобулины, денатурируются, в то время как альбумин не денатурируется и легко поддается 50 выделению. После обработки нагревом РН доводят до 3,5-4,5 для элюирования из смолисто-белковой смеси желательного альбумина, Смолисто-белковую смесь пеРед Регулировкой РН охлаждают, после чего значение РН доводят до 4. Выделяют альбумин осаждением, фкльтрацией или цектрифугированием, предцочтквельным способом является фильтрация смолисто-белковой смеси с отрегулированным РН, 60 промывкажмыха и сбор Фильтрата в виде желательной альбуминовой Фрак:ции,высокой степени чистоты. Регулировку РН на необходимый уровень осуществляют обработкой кислотным 45 или щелочным буфером, например буфером на основе ацетата натрия - уксусной кислоты или же лимонной кислоты, в целях подкисления или обработкой бикарбонатом катрия или гидроокисью натрия для подщелачивания. Предпочтительным является применение стабилизаторов альбумина, как натрийацетилтриптофанат к натрийкаприлат смеси смола-белок во время обработки нагревом с учетом их стабилизирующих свойств.П р к м. е р 1, Полиэлектролктный полимер состоит из смолистого продукта взаимодействия в основном зквимолярвых частей этилена с ангидридом малеиновой кислоты (АМК), по- перечно сшитого метилиминобиспропиламином(МИБПА) н затем подвергнутого взаимодействию с диметиламинопропилаиином (ДМПА) таким образом чтобы образовалось около, пяти МИБПА- сшивающих групп и около 90 ДМПА-дополнительных групп на 100 ед. АМК в АМК-сополимере, н превращенного в солянокислую соль. Вначале полиэлект. ролитный сополнмер промывают в0,04 М хлористом натрии, Плазму, полученную из смешанной человеческойкрови, разбавляют с применением3 частей воды на 1 часть плазмы после чего примешивают 2 вес, промытого полиэлектролитного сополкмера(2 г/100 мл), Значение РН смесисмола-плазма доводят до 6,0, затем30 мин перемешивают, Фильтруют нпромывают 0,002 М хлористым натрием,Фильтрат, в основном состоящий из Г-глобулинов, р -глобулинов,фнбриногена и ассоциированных кровяных факторов, выделяют нз полученного смолисто-белкового остатка на фильтре.последний, содержащий адсорбнрованный альбумнн, подкнсляют до РН 5,2, Для достижения 0,012 Мконцентрации к адсорбнрованному смолой белку примешивают надлежащее количество стабилизато" ра на основе каприлата натрия, для достижения 0,002 М концентрации добавляют хлорйстый натрий. После этого в течение 1 ч при 70 С поглоо щенный смолой белок нагревают, потом материал фильтруют, фильтратвыбрасываютАльбумин элюируют из оставшегося смолисто-белкового жмыха путем подкисления до РН 4,0 в 0,002 М хлористом натрйи лимонной кислотой, затем 30 мин перемешивают и фильтруют. Фильтрат собирают в виде же" лательной альбуминовой фракции с выходом 96,6 (в пересчете на концентрацию альбумина в первоначальной плазме) при степени чистоты 98,5. Степень чистоты элюированного из смолы альбумина определяютУагар-гель-электрофорезом в буфере на основе диэтилбарбнтуроаой кисло736861 Формула изобретения 1. Патент США В 3555001,кл. 266-112, опублик. 1969. Составитель С. МалютинаРедактор Т, Смирнова Техред Н.ковалева Корректор С, Щомак Заказ 2456/49 Тираж 673 ПодписноеБНИИПИ Государственного комитета СССРпо делам изобретений и открытий113035, Москва, Ж, Раушская каб., д, 4/5 Филиал ППП Патент, г. ужгород, Ул,.Проектная, 4 ты при рН 8,6 с применением электрофореэного устройства, Счет производят прн 600 нм с помощью денситомет.ра, Синий типа Сооазе 1 е Вг(И 16 МВ 2 ое к 250 является протеиновым красителем высокой чувствительности.За счет высокой степени чувствительности синиЙ типа СооъО 5 м ВГ 116 лВое Я 250 допускает определениебелковых примесей в альбуминовомпродукте с очень большой точностью,а проведенный количественный анализ подтверждает получение альбумина высокой степени чистоты,П р и м е р 2. Повторяют способпримера 1 эа исключением того, чтбисходная плазма представляет собойАНГ-обедненную плазму. Выход и степень чистоты альбуминового продукта в основном такие же, как в примере 1.П р и м е р 3. Повторяют способпримера 1 за исключением того, чтовключают промежуточную стадию между первой фильтрацией и горячей обработкой в целях удаления дополнительных глобулкнов и Фибриногенакз плазмы. На этой промежуточнойстадии рН смолисто-белкового остатка на фильтре от первой фильтрациидоводят до 4,7 в 0,002 М хлористомнатрии лимонной кислотой, перемешивая затем в течение 30 мин, Смесьфильтруют, проьщвают и потом под"вергают обработке нагревом, затемстадиям примера 1, Фильтрат от обработки с достижением рН 4,7 содержит й и-глобулины и фибркноген,которые собирают для использованияв различных кэвестных терапевтических и диагностических целях. целевой альбумин получают с выходоми степЕнью чистоты в основном аналогичными примеру 1.Следуя способу выделения очищенного альбуминового продукта, альбумин концентрируют до требуемогоуровня, рй концентрированного продукта доводят до физиологическиприемлемого значения и содержанияэлектролита, затем нагревают дляуничтожения вирусов, доводят допрозрачного состояния фильтрациейили иными способами для палученияклинически пригодного вещества, соответствующего требованиям, предъявляеьим к обычиову сывороточному материалу. К предаочтительному способу концентрироваиия гсркмекяемомуна практике, откоеатся лиофилиэацкяс последующим перерастворением дожелательной кокцеверацкк, например 15 5 или 25-кая ульмрафильтрация.Предлагаемый сиесоб позволяетповысить выход целевого продукте дб966% при степени чистоты 98,5%. Способ получения Фракции сывороточного альбумика путем адсорбцик 25 на нерастворимых в воде цоперечяосшитых полиэлектроактных сополкмерах этилена с ангидридом маленковойкислоты с содержанием дополнительных дкметиламинопропиловых фунциональных групп с последуюэям элюироваьием целевого продукта, о тл и ч а ю щ и й с я тем, что, сцелью повьиаенкя чистоты и выхода целевого продукта, адсорбцию проводятна сополкмере при рН 5-5,5 и температуре 65-72 оС в течение 1-4 ч изатем устанавливают рН смеси 3,54,5. Источники информации,40 принятые во внимание при .экспертизе