Способ очистки гепарина

Ж 1 йяеи фф тынОПИ Союз Советскнх Сецнапнстнческнх Респубпнк(И) М. Кл,(23) Приоритет. - (32) 05,03,76 А 61 К 35/42 6 01 М 33/16 Государственный комиот СССР ио лолам изобретений и открытийЛата опубликования описания 26.05,80 Иностранцы Ларс-Олон Андерссон и Эрик Ингне Холмер(72) Авторы изобретения Иностранная фирма АБ КАБИ (Швеция)(54) СПОСОБ ОЧИСТКИ ГЕПАРИНА Изобретение относится к химикофармацевтической промышленности, аименно к очистке гепарина.Известен способ очистки гепаринапутем осаждения комплекса гепарин"белок Чоляной кислотой, протеоли-.тического разрушения белка, много"кратного переосаждения целевого продукта и пропускания через ионообменные смолы. Активность гепарина100 ед/мг,Целью изобретения является повышение активности целенсго продукта,Это достигается тем, что гепаринрастворяют н. буферном растворе с: рН от 5 до 9,5, адсорбируют на гельсефарозы, коньюгиронанный 1 с анти,тромбином или с интер-с-трилсином иэлюируют буфером,П р и м е р 1, Очистка гепаринана связанном с матрицей гепарине,Геленый адсорбент прйготавливают следующим образом,3 г ВгСМ растворяют н 30 мл дис",тиллированной воды. 50 мл осажденной агарозы добавляют к растворуВгСЙ. Смесь при перемешивании охлаждают в водяной бане. При добанлении 4 М Р(аОН поднимают рН до 11,2 ивыдерживают постоянным н течение 10 мин, Затем гель промывают холодной дистиллированной водой и0,2 М маНСО 3.200 мг антитромбина, очищенногопо Миллеру-Андурссону й растворенного н 50 мл 0,2 М МаНСОз, при рН 9;0.добавляют в гель. Гель-протеиновуюсуспенэию осторожно перемешиваютйри комнатной температурен течениеночи и затем осторожно промывают сбуфером при высокой концентрацииионов при попеременно высоких и низ- ких значениях рН.Геленый адсорбент, содержащий )8 связанный с матрицей антитромбин,помещают в колонку и уравновешивают с 0,05 М. триса, 0,15 М МаСО,рН буфера 7,4, 300 мг гепарина/индивидуальная активность 130 ед/мг)растворяют в 20 мл 0,05 М триса,0,15 М МаСВт рН буфера 7,4 и прокачинают через колонку. После этогогель проплывают буфером, а адсорбированный гепарин затем десорбируют0,05 М триса, 1,0 М МаСС, рН буфера7,4, Из элюированного гепарина уда"ляют соль путем фильтрации геля вдистиллированной воде в колрнке,заполненной сефадексом Я, после ф чего гепарин высуШивают ныморажива1 Ф3." 736860 формула изобретения Составитель С. МалютинаТехред И,Асталош Корректор М, Коста Редактор А, Бер Заказ 2456/49 . Тираж 673 Подписное БНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж, Раушская наб , д, 4/5Филиал ППП Патентф, г, ужгород, ул. Проектная, 4 наем. Изучение распределения моле-.кулярных весов показывает, что онимеет значительно более ограниченное распределение молекулярного веса, по сравнению с первоначальнымгепарином,П р и м е р 2. Антитромбиновуюматрицу готовят по способу,(укаэанному в примере 1.Очистка гепарина: 500 мг гепарина/активность 130 ед/мг) растворяют в 300 мл 0,05 М триса, 0,15 МйаС 1, рН буФера 7,4, 300 мл осажденного связанного с матрицей антитромбина уравНивают в буФере И высушивают отсасыванием. Адсорбент добавляютв раствор гепарин), который затемперемешивают при комнатной температуре в течение одною) часа, Гель высу-.шивают отсасыванием на стеклянномфильтре и промывают 10200 мл0,05 М триса, 0,15 М НаЯ, рН буфера 7,4. Адсорбированный гепаринзатем десорбируют иэ геля путем применения 3200 мл 0,05 М триса,1,0 М йаС, рН буФера 7,4, Элюированный геларин концентрируют высуащвают вымораживанием,., Оставшуюсясоль удаляют фильтрацией геля наСефадекс 6-25 в дистиллированной воде и затем гепарин высушивают вымораживанием. Активность очищенногогепарина 250 ед/мг.П р и м е р 3. Очистка гепаринана гелевом адсорбенте, содержащемсвязанный с матрицей ингибитор интер-Ы-трипсин,Приготовление гелеваго адсорбента,.В ходе очистки фактора коагуляции(х(В - фактор) получают интер-а(.-трипсин ингибитор протеин-связываю.щего гепарнна. Его мол, в. 150000,250 мг этого протеина растворяют в200 мл 0,2 М йаНСО 3, рН буфера 9,0и затем добавляют к 50 мл осажденной сефароэы %4 В, активированной сВ-СМ аналогично примеру 1.Гель-протеиновую суспенэию осторожно перемешивают при комнатной температуре в течение ночи. Затем гельпрогрызают так же, как в примере 1,Очис 1 ка гепарина,Гелевый адсорбент, содержащийсвязанный с матрицей протеин, помещают в колонку, 300 мг гепарина .растворяют в 20 мл 0,05 М триса,15 0,15 М ИаСС, рН буфера 7,4 и прокачивают через колонку.Гель промывают буфером и адсорбированный гепарин затем десорбируют0,.05 М триса, 1,00 М ЙаСЕ, рН буфе20 ра 7,4. Соль удаляют иэ гепарина путем фильтрации геля на Сефадексбв дистиллированной воде и затемгель высушивают вымораживанием, Активность очищенного гепарина230 ед/мг.Предлагаеьий способ позволяет повысить активность целевого продукта,Способ очистки гепарина путем адсорбции, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что, с целью повышения активности целевого продукта, гепарин растворяют в буферном растворе с рН от 5 до 9,5, адсорбируют на гель сефароэы, конъюгированный с антитромбиком или с интер-(-трипсином и элюируют буфером.