Способ получения препаратов протеолитических ферментов

ючд ЖЪ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУСоюз Советских Социалистических Республик(22) Заввлено 010977 (21) 2527203/23-04с присоединением заявки Нов. Государственный комитет СССР по делам изобретений и открытий(73) ЗаяВИтЕЛИ медицинских полимеров и Институт биоорганической химии АН СССР им. М.М.Шемякина(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПРЕПАРАТОВ ПРОТЕОЛИТИЧЕСКИХФЕРМЕНТОВ Известны раз,ггичные способы получения ковалентных производных белков и ферментон, например, с.-химотрипсина, с природными или синтетическими полианионами, в частности - с карбоксиметилцеллюлозой (КМЦ) . Получение таких производных достигается за счет образования ковалентной связи между аминогруппой белка и предварительно активированной карбоксильной группой полиэлектролита и, таким образом, делится на два этапа: 1 актиниронание полиэлектролитной матрицы; П - образование ковалетной связи между Ферментом и активиронанной матрицейИзвестные способы получения ковалетных производных Ферментов с полисахаридными матрицами различаются по способу активирования матрицы. Среди наиболее распространменных способов получения водорастворимых коналентных производных ФерНастоящее изобретение относится к области химической энзимологии и может быть использовано для получения нодорастноримых коналентных про. изводных протеолитических ферментов с полисахаридами для медицинских и биохимических целей. 2ментов с кислыми полисахаридамиследующие:1) получение ковалентных производных путем взаимодействия белка с 5 азидом КМЦ, получающимся путемпоследовательной обработки метилового эфира КМЦ гидраэин-гидратом инитритом натрия (1);2) получение ковалетных проиэвод О ных путем взаимодействия белка с предварительно окисленной, действиемхлорной кислоты КМЦ, сефароэой илисефадексом, В результате такого окисления глюкозидные кольца КМЦ полг 5 ностью или частично раскрываются собразованием альдегидных групп (2)и практически получается новый полимер с однозначно не идентифицированной первичной структурой, полностью 2 О или частично утрачивающий свою полисахаридную природу.Из двух перечисленных выме способов получения коналентных производ-:ных лишь первый может рассматривать ся как способ получения производныхФерментов с полисахаридом, т.к. и результате другого способа, как ужеуказывалось, полиэлектролитная матрица утрачивает свою полисахаридную Зо природу.Наиболее близким к настоящему изоб- ретению является способ получения водорастворимого, модифицированного кислым полисахаридом препарата протеолитического фермента ( сС -химотрипсина), описанный в работе 1. В качестве кислого полисахарида в известном способе используется КМЦ, Согласно известному способу получение модифицированного препарата осуществляется в два этапа и 5 стадий.1 этап - получение активированной Формы (азида) КМЦ;1) получение метилового эфира КМЦ путем обработки КМЦ метиловым спиртом в присутствии хлористого водорода;2) получение гидразида КМЦ путем 5 обработки метилового эфира КМЦ гидразин-гидратом;3) получение азида КМЦ путем обработки гидразида КМЦ нитритом натрия.П - этап - получение ковалентного 20 производного сС -химотрипсина с КМЦ:4) получение. ковалентного производного КМЦ с химотрипсиногеном путем обработки аэида КМЦ химотрипсиногеном; 255) получение ковалентного производного с(,-химотрипсина КМЦ путем обработки ее химотрипсиногенового производного, не обнаруживающего ферментативной активности, трипсином. Стадии получения производного с(,-химотрипсина с КМЦ через химотрисиногеновое производное объясняется необходимостью избежать инактивации фермента в роцессе реакции.35Однако этот способ имеет ряд существенных недостатков:а) многостадийность синтеза производного, значительно усложняющая его осущесткление 1б) воэможность химической деструк ции полисахаридной матрицы при насыщении раствора КМЦ в метиловом спирте газообразным хлористым водородом (на стадии синтеза метилового эфира КМЦ); 45в) наличие двух фракций получаемого продукта - водорастворимой и водонерастворимой, и необходимость ихразделения;г) необходимость очистки получаемого химотрипсинового производного КМЦ от трипсина;д) ограниченность круга Ферментов,ковалетные водорастворимые производ. ные которых могут быть получены этим 55способом без значительной их инактивации.Целью описываемого способа является исключение многостадийности процесса, упрощение стадии очистки и расширение круга протеолитических ферментов, сохраняющих высокую активность в процессе получения модифицированных кислыми полисахаридами препаратов-. указанная цель достигается за счет того, что в качестве кислого полиса 65 харида используют альгиновую кислоту,водный раствор соли любого одновалентного катиона которой подкисляютдо достижения рН 1,01,5, а образовавшийся осадок растворяют в буферном растворе Фермента.Смысл описанной процедуры заключается в том, что при подкислениираствора альгиновой кислоты происходит ее частичная ангидридизация, 4 о-удификация фермента кислым полисаха"ридом происходит за счет взаимодействия нуклеофильных групп ферментана поверхности белка с ангидридныМИгруппами кислого полисахарида.Согласно изобретению описываетсяупрощенный способ получения водорастворимых препаратов модифицированных кислыми полисахаридами протеолитических ферментов, в котором в качестве кислого полисахарида используют альгиновую кислоту, водныйраствор соли которой подкисляют додостижения рН 1,0 - 1,5, а образовавшийся осадок растворяют в буферном растворе фермента.Предпочтительно процесс проводятследующим образом:к 0,5 раствору альгината натриядобавляют концентрированную солянуюкислоту до достижения рН 1,0. Осадокотделяют центрифугированием либоФильтрованием, промывают водой дорН 3,0 и лиофильно высушивают. Однувесовую часть ангидридизованной альгиновой кислоты растворяют при перемешивании в охлажденном до 4 ОС 0,2 Мрастворе фосфатного буфера, рН 7,5,содержащем одну весовую часть протеолитического фермента. Продолжаютперемешивание раствора при 4 С в течение 24 ч, Далее раствор подкисляютдо рН 2,0 и модифицированный препаратфермента отделяют центрифугированиемили фильтрованием. Продукт очищаютот непрореагировавшего фермента много-экратной промывкой препарата 10 н.раствора соляной кислоты и 2 М раствором хлористого натрия в 10н.растворе соляной кислоты попеременно. Очищенный продукт растворяют в воде илиофильно высушивают,П р и м е р 1. Получение производных сС -химотрипсина с альгиновойкислотой. Стадия 1. Получение альгиновой кислоты в ангидридизованной форме.К 0,5 раствору альгината натрия добавляют концентрированную соляную кислоту до достижения рН раствора, равного единице. Образующийся осадок отделяют центрифугированием либо фильтрованием, промывают дистиллированной водой до рН 3 и лиофильно высушивают. Определение концентрации ангидридных групп в полученном продукте проводят по методу Меншуткина.70794 Формула изобретения Составитель А.Бочаров Техред Э.Чужкк Корректор М Пожо Редактор Н.Хайтовская Подписное Заказ 8430/21 Тираж 495 ЦНИИПИ 1 осударственного комитета СССР по делам изобретений к открытий 113035, Москва, Ж, Раушская наб,р д, 4/5Филиал ППП Патент, г, Ужгород, ул. Проектная, 4 Для этого 0,1 г полученной ангидридизованной кислоты вносят в 10 мл1%. раствора мета-нитроанилина в спирте и добавляют 10 мл воды. Послевыдерживания реакционной смеси прикомнатной температуре в течение 2 чв темноте оставшиеся свободными кар 5карбоксильные группы титруют 0,1 Мраствором гидроокиси бария с индикатором фенолфталеином, Содержаниеангидридных групп рассчитывают порезультатам титрования, исходя изтого, что при обработке мета-нитроанилином половина всех ангидридизованных карбоксильных групп превращается в анилид. Определенное такимобразом количество карбоксильных 15групп альгиновой кислоты, включенный в ангидридные связи, составляетОколо 30 оСтадия 2. Получение ковалентныхпроизводных с(.-хкпотрипсина с альгиновой кислотой1 г ангидридизованной альгиновойкислоты, полученной на стадии 1, какописано выше, растворяют при перемешивании в охлажденном до 4 С 0,2 Мраствора фосфатного буфера рН 7,5,содержащем 1 г К-хкмотрипсина. После 24 ч перемешивания реакционной смеси при температуре 4 С получившеесяковалетное производное сС-хкмотрипсина с альгиновой кислотой послеподкисления раствора до рН 2,0 выделяют центрифугированием или фильтрованием. Продукт очищают от непрореагировавшего О-химотрипскна многократной промывкой раствором соляной-зкислоты 1:10 н, и 2 М раствором хлористого натрия в 110 М растворесоляной кислоты попеременно до полного отсутствия белка в надосадочнойжидкости, регистрируемого спектрофотометрическк при 280 нм. Очищенныйпродукт после заключительного промывания 1 10 М раствором соляной кислоты растворяют в дистиллированнойводе к лиофильно высушивают. 45Содержание белка в полученномпродукте, определенное спектрофотометрически, а также по элементному иаминокислотному анализу, составляет240-258 мг/г препарата, Ферментнаяактивность полученного продукта,определенная по стандартному субстра"ту в ,этиловому эфиру И-ацетклтирозина(АТЭЭ) составляет 66-70 мг активногофермента на 1 г препарата, Продуктхорошо растворим в воде. П р и м е р 2, Получение производных пепсина с альгиновой кислотой.0,1 г ангидридизованной кислоты, полученной на стадии 1 примера 1, растворяют при перемешиваник в охлажденном до 4 С 0,1 М ацетатном буфере рН 4,8, содержащем 0,1 г пепсина. Получение и выделение ковалентного производного пепсина с альгиновой кислотой ведется как в примере 1.Содержанке белка в полученном препарате - 112 мг/г.Протеолитическая активность по гемоглобину - 22000 пепсиновых единиц. Препарат- имеет высокую водорастворимостьП р и м е р 3, Получение производных трипсина с альгиновой кислотой.По методике, описанной в примере 1, получают ковалентное производное трипсина с альгиновой кислотой, взяв вместо - химотрипсина такое же,количество трипсина, Ферментная активность полученного препарата, определенная по стандартному субстрату зтиловому эфиру И-ацетклбензоиларгинина - составляет 60-65 мг/г препа- . рата. Количество связанного белка составляет 220 мг/г препарата. Продукт легко растворим в воде. Способ получения препаратов протеолитических Ферментов путем обработкиих кислыми полисахаркдами, о т л и - фч а ю щ и й с я тем, что, с цельюупрощения способа и расширения круга.ферментов, сохраняющих высокую активность, в качестве кислого полисахарида используют альгиновую кислоту,водный раствор соли юпобого одновалентного .катиона, которой подкисляют додостижения рН 1,0-1,5, а образовавшийся осадок растворяют в буферномрастворе фермента.Источники информации,принятые во внимание при экспертизе1, Ра 1 ат, Р.,Н 1 гясЬ Н. "Мод 1 Е 3. - .хат.1 опеп цпй Мо 1 еКц 1 агдеж 1 сйяЧегсх оЬегцпуеп оп сс-С)упо 1 гуря 1 п"Е.Иа 1 цаГогяс)шп 9, 216, 36-42, 1966(прототип),2, Торчилин В.А Рейвер И.Л.,Смирнов В.Н.,Чазов Е.И.,Иммобилкзация Ферментов на бкосовместимых носителях.Е 1,Иммобилизация . -химотрипсина нарастворимых декстранах.Биоорганкческая химияф,т.2, Р 9 с.1252, 1976