Способ выделения и очистки декстраназы

Сфаз СоветскихСоциалистическихРеспублик ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ(22) Заяалеио 270777 (21) 2511445/28-13 (51)М. Кл. 07 0 7/028//С 12 В .13/10 с лрисоедииеиием заявки М -Государственный комитет СССР по делам изобретений и открытийОпубликовано 05,0180. Бюллетень И 91 Дата опубликоеания описания 05,01,80 Т.И,Данилова, В,И.Максимов и Г.А.Молодова(54) СПОСОБ ВЫДЕЛЕНИЯ И ОЧИСТКИ ДЕКСТРАНАЗЫ Предлагаемый способ относится к Ферментной области микробиологической промышленности, он может быть использован в производстве и очистке Ферментов, полученных из микроорганизмов. По этому способу осуществляется выделение и очистка Фермента декстраназы при глубинном культивировании микробных продуцентов, в частности, грибов рода Реп 1 с 11 Е 1 цв или Гизаг 1 цв с использованием приемов солевого осаждения фермента и адсорбции его на алюмосиликатныхглинистых минералах.Минеральные сорбенты широко используют для очистки ферментов. Известен способ 1), согласно которому декстранаэу сорбируют иэ исходного раствора культуральной жидкости на глине при рН 4,0-5,0 и 2 О десорбируют при рН 7-9. Затем добавляют анионит ДЭАЭ-целлюлозы к полученному раствору .фермента, при этом. фермент связывается с анионитом, после чего проводят элюирование фермента с ионитаВ качестве глин-сорбентов, декстраназы применяют каолин, получая наилучшие результаты, а также фулерову землю, Флоридин, бентонит и другие.Основными недостатками известногоспособа очистки Фермента являютсямногостадийность и трудность реализации способа в условиях крупномасштабного производства вследствиеиспользования дорогостоящих анионитов на полисахаридной основе, а также наличия стадии обессоливанияраствора Фермента после элюированияс ДЭАЭ-целлюлозы, Кроме того, поизвестному способу не проводитсяпредварительная обработка глины сцелью повышения ее адсорбционнойспособности, нет сведений о степениочистки ферментного препарата отуглеводных примесей.Цель изобретения - повышениестепени чистоты фермента, а такжеупрощение .технологического процесса его получения,Цель достигается тем, что передсорбцией фермент осаждают иэ культуральной жидкости сульфатом аммония,полученный осадок растворяют в водеили буфере, а сорбцию ведут при предварительно активированном минеральном сорбенте.707925 Таблица 1 Фракция, содержащая Фермент Глина обработанная кислотой необработанная прогретая Активностьфермента,глюкоз.ед. ВыходферментаАктивность Выход фермента, фермен глюкоз.ед. та,Активность Выход ф:.рмента, ферменглюкоз,ед. та,Супе 9 натантпосле сорбцииФермента наглину 49 8000 24600 18 26 3200 Элюат (последесорбции) 25400 51 82 35500 90000 74 П р и м е ч а н и е. Концентрация аскангеля 1. Из.табл.1 видно, что без активирования глины выход фермента после десорбции составляет только 51, при активировании - повышается до 80 30 и более.Ферментные препараты, подвергавшиеся предварительной очистке путем осаждения сульфатом аммония, содержат достаточно высокие концентрации этой 35 соли, отделение которых в лабораторных условиях может быть осуществлено диалиэом или гель-фильтрацией. В про-язводстве эти приемы приводят к значи Т а б л и ц а 2 Иаходна ная кул жидкост есклеточральназ 5 - 6 610 Раство ный по мому с ле дес раназы полу предл особу рбции с гли 3 чен- гае- посдекст ы 3450036070 57-60 77 350-45 Примгриба Реп 3. выращивают 0,8 декс Способпромишленочищенныхдицинског ожет найти применениеом производстве высоко ерментов декстраназыназначения,Для активирования сорбента были испытаны разные способы: 1) обработка 3 объемами концентрированной соляной кислоты в течение 2-3 ч при комнатной температуре с последующей промывкой глины водой и центрифугированием для отделения глины от жидкости; 2) прогрев сухого порошкафаскангеля в сушильном шкафу при200 фС в течение 4-5 ч,Сравнительные данные о влиянииспособа обработки глины на результаты сорбции.и десорбции приведеныв табл.1. тельному удорожанию получаемого продукта. Однако оказалось, что присутствие сульфата аммония в растворе 1декстраназы не мешает сорбции этого фермента на глине, что позволило исключить промежуточную стадию обессоливания раствора фермента после его фракционирования сульфатом аммония. В табл.2 приведена характеристикаэффективности предлагаемого способаочистки декстраназы от примесей. е р 1. Посевной материал3.111 шп йип 1 си 1 озив шт,153 сут, на питательной средерана, 0,08 КИРО, 0,1707925 Формула изобретения Источники информации,принятые во внимание при экспертизе 1. Патент США 93627643, кл,195-66,опублик. 1971. Тираж 495 ПодписноеФилиал ППП Патент, г. Ужгород, ул. Проектная, 4 МаМО, 0,06 МцЯ 04,0,02 КС 1, рН6,0) в колбах емкостью 750 мп на качалке при 30 С, Культуру выращиваютна той же среде в колбах емкостью750 мл (по 300 мп культуры в колбе)в течение 4 сут. Биомассу отделяютцентрифугированием, а бесклеточнуюкультуральную жидкость при рН .4,4(подкисление проводят концентрированной уксусной кислотой) упариваютв 10 раз в колбе емкостью 10 л принаружной температуре 40 С. Из 10 лкультуральной жидкости получают1 л концентрата. К этому растворудобавляют 460 г сульфата аммония(в расчете 70 от полного насыщения).Оставляют на ночь в холодильнике,Осадок отделяют центрифугированиемпри 3000 об/мин в течение 15 мин ирастворяют в 200 мл воды. Нерастворившуюся часть отделяют центрифугированием, а раствор, содержащий 2 Одекстраназу, подкисляют до рН 4,5концентрированной уксусной кислотой,К этому раствору прибавляют аскангельв количестве 2 по сухому весу глины.Аскангель предварительно активируютС этой целью глину заливаютконцентрированной соляной кислотойиз расчета 1:3 (вес:объем) и оставляют при комнатной температуре втечение 2,5 ч, периодически переме- ЗОшивая всю смесь. После отстаиваниясмеси и осаждения глины кислоту сливают, а глину отмывают дистиллированной водой до рН 5,0.Для сорбции декстраназы на активированном аскангеле раствор Фермента перемешивают на магнитноймешалке в течение 1,5 ч при комнатной температуре. Глину с адсорбированном на ней ферментом отделяютцентрифугированием при 3000 обминв течение 10 мин. Затем глину проьывают 250 мп 0,01 М ацетатного буфера рН 4,4 и повторно отделяютцентрифугированием,Для десорбции Фермента с аскангеля добавляют 75 мл 0,05 М трис"НС 1буФера рН 8,6 при постоянном перемешивании в течение 0,5 ч, глину отде"ляют центрифугированием и повторнообрабатывают 35 мп того же буФера. ООба супернатанта соединяют, получают 110 мп раствора очищенного Фермента, характеристики которого соответствуют данным, приведенным втабл.2.П р и м е р 2. Фермент получаюттак же, как в примере 1, только активирование аскангеля осуществляютпо следующей методике. Комерческийматериал аскангель помещаютв сушильный шкаф и выдерживают при200 фС в течение 4 ч. ПолученныйбКЛажденный образец используют в каЦНИИИПК Заказ 8430/21 честве активированной глины, Характеристика фермента приведена в табл. табл,2.П р и м е р 3, Для выделения Фермента в лиофильносухом состоянии используют раствор, полученный в примере 2. 230 мл этого раствора смешивают с аскангелем, активированным термообработкой, описанной в примере 2Сорбцию фермента на глину проводят так же, как это описано .в примере 1, Десорбцию осуществляют водой, рН которой доводят до 8,2, добавляя небольшое количество карбоната аммония. Выход фермента после десорбции более 90. Раствор высушивают лиофильно.Таким образом, по предлагаемому способу последовательного проведения стадий солевого осаждения и сорбциидесорбции на аскангеле, а также благодаря предварительному активированию аскангеля термообработкой или обработкой кислотой получают декстраназу высокой степени чистоты как по белку,так и по углеводам. Кроме того, обнаружена способность декстраназы сорбироваться на активированном аскангеле из ее растворов; содержащих значительные йримеси соли (сульфата аммония), что позволило вести очистку фермента без применения специальных стадий обессоливания раствора. 1Способ выделения и очисткидекстраназы из культуральной жидкости плесневых грибов, предусматривающий сорбцию фермента на минеральномсорбенте при рН 40-5,0 и десорбциюего с минерального сорбента при рН7,0-9,0, о т л и ч а ю щ и й б ятем, что, с целью повышения степеничистоты препарата и упрощения технологического процесса его получения,перед сорбцией Фермент осаждают изкультуральной жидкости сульфатомаммония, полученный осадок растворяют в воде или буфере, а сорбциюведут на предварительно активированном минеральном сорбенте,2, Способ по п,1, о т л и ч а ю -щ и й с я тем, что в качестве минерального сорбента используют аскангель.3. Способ по пп. 1 и 2, о т л и -ч а ю щ и й с я тем, что минеральный сорбент активируют концентрированной соляной кислотой или термообработкой,