Способ приготовления сорбента”

т О П И С А-И-"И ИЗОБРЕТЕНИЯ Союз Советских Социалистических Республик(22) Заявлено 31,08.77 (21) сприсоединением заявки(23) Приоритст -Государственныи комите СССР по делам изобретений и открытий(45) Дата опубликования описания 30.03.80(72) Авторы изобретения В. Н, Борисова, С. Е. БИ. В. Красильников,Б. В, Мчедлишвили,Институт полиомиелитЛенинградский политеи Всесоюзный научн реслер, Н. С. ГоловинВ. М, Молодкин, Л.Л, А, Нахапетян и Ла и вирусных энцефдлхнический институт ио-исследовательскийинститут, В. М. Коликов,М, Молодкина, Б. Эльберт тов АМН СССР,, М. И, Калининаиотехнический 71) Заявител 54) СПОСОБ ПРИГОТОВЛЕНИЯ СОРБЕ Изобретение относится к микробиологической промышленности, а именно к технике приготовления сорбентов для очистки вирусных суспензий, используемых для изготовления вирусных антигенов и вакцин. 5Известен способ приготовления сорбентов для очистки вирусных суспензий путем последовательной обработки поверхности макропористого кремнезема модификаторами с последующим промыванием сорбентд 10 ,и уравновешиванием буфером Ц.Однако сорбент, полученный известным способом, не обеспечивает высокого выхода из колонки некоторых вирусных препаратов и необходимой чистоты очищаемого вирус ного материала вследствие недостаточно прочного связывания модификатора с поверхностью кремнезема. Кроме того, такой сорбент подвержен действшо протеаз, что вызывает загрязнение вирусного прспграта 20 посторонними белками.Цель изобретения - предупреждение попадания в вирусный препарат молекул биологически активного модификатора и повышение устойчивости сорбента к фер ментативным воздействиям.Указанная цель достигается тем, что поверхность макропористого кремнезема модифицируют последовательной обработкой 1 - 10%-ным раствором гамма-аминопро 30 пилтриэтоксисплана и 1 - 5 О/о-ным раствором глутарового альдеп 1 да, затем полученный сорбент промывают дистиллированной водой и влажный сорбент смешивают в равных количествах с 0,5 - 1,5 М раствором трис(-оксиметпл-) ампномстана.Способ осуществляется следующим образом.1 объем макропористого кремнезема обрабатывают 1 - 10%-ным раствором гаммааминопропплтрпэтокспсцлана в ацетоне, здтем высушивают и смешивают с 1 объемом 1 - 5 О/О-ного раствора глутарового альдегида. Полученную суспензию персмешивают в течение 1 ч, после чего кремнезем отфильтровывают и промывают дистиллированной водой. Затем 1 объем влажного кремнсзсма смешивают с 1 объемом 0,5 - 1,5 М раствора трис-НС буфера. После 2-часового псремешпванпя в трис-НС буфере кремнезем отфильтровывают, промывают дистиллированной водой, уравновешивают нужным буферным раствором и загружают в колонку.Затем суспензпю, содержащую вирус, нося в готову 1 о хроматог 1 афическуо колонку и элюпруют через колонку с помощью буфера, которым колонка предварительно уравновсшена. Элюат из колонки собирают во фракции, которые в дальней55 60 шем анализируют на содержание вируса и примесей белка.,П р и м е р 1, К 60 см макропористого стекла (МПС) прибавляют 60 мл 1 - 10% -ного раствора гамма-аминопропилтриэтоксисилана в ацетоне, хорошо перемешивая, высушивают на воздухе, а затем в сушильном шкафу при 110 С в течение 6 ч. Концентрацию аминогрупп на поверхности такого стекла определяют в пределах О,1 - 1,2 мг экв/г. К обработанному таким образом стеклу прибавляют 90 мл 0,25 М фосфатного буфера (рН 7,0) и 10 м г 25%- ного водного раствора глутарового альдегида и перемешивают 1 ч при комнатной температуре, К промытому водой стеклу прибавляют 100 мл 1 М трис-НС 1 буфера (рН 7,0), полученную суспензию перемешивают 2 ч, промывают водой и загружают в хроматографическую колонку (0,9 х 14 см). После заполнения сорбентом колонку уравновешивают элюирующим буфером. Элюентом может служить 0,05 - 0,1 М фо"фатносолевой буфер с содержанием 0,1 - 0,2 М хлористого натрия.(рН 7,4 - 8,0) или 0,05 - 0,1 М трис-буфер с 0,15 М хлористого натрия (рН 7,5 - 8,0). Скорость элюции можно изменять в пределах 0,1 - 4,0 си/мин,. Культуральную жидкость, содержащую вирус клещевого энцефалита (шт, Софьин иди Пан) или суспензию вируса гриппа (шт, МРЦ 11) объемом 0,2 - 1,0 мл вводят в колонку и элюируют буфером, которым колонка уравновешена, В 4-м - 5-м мл элюата выходит очищенный вирус. Белковые примеси выходят из колонки, в 8-м - 1 О-м мл элюата и не содержат практически вирусной активности. Выход вируса из колонки зависит от концентрации групп трис(-оксиметил-)аминометана на поверхности кремнезема. И в оптимальном случае (0,3 - 0,4 мг экв/г) выход как вируса клещевого энцефалита, так и вируса гриппа составлял 90 - 100 О/о от вирусной активности, введенной в колонку. П ри м ер 2. К 25 мл силохрома С, обработанного предварительно растворами гамма-аминотриэтоксисилана и глутарового альдегида, как описано в примере 1, приливают 25 мл 1 М трис-НС 1 буфера (рН 6,85) и перемешивают в качалке 2 ч при комнатной температуре. После отмывки дистиллированной водой полученный сорбент уравновешивают в элюирующем буфере и загружают в колонку (0,8 х 12,0 см). В эту колонку вводят 0,5 - 1,0 мл суспензии вируса клещевого энцефалита или вируса гриппа и проводят элюцию. Элюентом являются буферные растворы, приведенные в примере 1. В 3-м - 4-м мл элюата выходит 100/, вирусной активности, внесенной в колонку. Примесные белки и низкомолекулярные вещества элюируются в 7-м и 8-м мл 5 1 О 15 20 25 30 35 40 45 50 П р и м е р 3, Макропористое стекло (МПС), модифицированное трис(-оксиметил-) аминометаном с содержанием на поверхности модификатора 0,4 мг экв/г, подвергают последующему восстановлению, которое проводят следующим образом.К высушенному модифицированному, как описано в примере 1, стеклу добавляют 60 мл дистиллированной воды и 60 мл 0,1% -ного раствора ХаВН 4 и в течение 30 мин интенсивно перемешивают, Затем обработанное таким образом стекло отмывают дистиллированной водой, уравновешивают элюирующим буфером и загружают в колонку (0,8 х 12,0 см). Через колонку пропускают суспензию с активным,или инактивированным формалином вирусов клещевого энцефалита объемом 0,5 - 1,0 мл. Условия элюирования аналогичны условиям, приведенным в вышеописанных примерах. Выход как активного, так и ;инактивированного вируса из колонки составляет 100/о.Модификация макропористых кремнеземов трис(-оксиметил-) аминометаном делает возможным их использование для гельфильтрационной хроматопрафии вирусных суспензий. Такой способ приготовления сорбента устраняет адсорбцию вирусных частиц на поверхности макропористого кремнезема и позволяет производить без потерь очистку вирусного материала.Использование в качестве модификатора трис(-оксиметил-)аминометана не вызывает загрязнения очищаемых вирусных препаратов биологически активными молекулами, так как он не является биологически активным веществом (он входит,в состав кровеза менителя) .Данный способ получения сорбента технологически несложен. Полученный сорбент отличается постоянством свойств и долговечностью за счет химического связывания . молекул триса с поверхностью стекла,Модифицированный трис (-океиметил-) аминометаном кремнезем не подвержен воздействию различных ферментов, содержащихся в суспензиях вирусов. Это расширяет возможности применения сорбента, полученного данным способом, в частности, делает его пригодным для применения в хроматографии различных ферментов.Формула изобретенияСпособ приготовления сорбента для очистки вирусных суспензий путем последовательной обработки поверхности макро- пористого кремнезема модификаторами с последующим промыванием сорбента и уравновешиванием буфером, о т л и ч а ю щ и йс я тем, что, с целью предупреждения попадания в вирусный препарат молекул биологически активного модификатора и повышения устойчивости сорбента к ферменОтсттлПттстаг ПЛ ъплтюлтпттпаЛ пЛВДПюттЛЛЪс австро ъ671385 Составитель В, Головин Техред В. Серикова Корректор С, Файн Редактор Е. Месропова Заказ 229/335 Нзд.233 Тираж 522 Подписное НПО Поиск Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий П 3035, Москва, Ж, Раушская наб., д. 4/5Тип. Харьк, фил. пред. Патент пористого кремнезема модифицируют последовательной обработкой 1 - 10% -нымраствором гамма-аминопропилтриэтоксисилана и 1 - 5%-ным раствором глутарового альдегида, затем полученный сорбент промывают дистиллированной водой и влажный сорбент смешивают в равных количествах с 0,5 - 1,5 М раствором трис(-оксиметил-) аминометана. Источник информации, принятый во5 внимание при экспертизе: 1. Сборник трудов ИП и ВЭ, М., 1972, с. 18 - 19.