Способ получения вирусных гемагглютининов

Союз Советских Социалистических Республик(23) Приоритет т 1) М. К.,.осударственный комитет овета Министров СССРубликования описания 1 б.12.7 45) Дата 72) Авторы изобретения О. В. Давыдов и А, В. Ефим Заявитель елорусский ордена Трудового Красного Знамени научноследовательский институт эпидемиологии и микробиологии ЛУЧЕНИЯ ВИРУСНЫХ ГЕМАГГЛЮТИНИН) СПОС Изобретение относится к области медицины, в частности к вирусологии.Известен способ получения парагриппозныхгемагглютининов путем последовательной обработки вируссодержащей жидкости детергентом - сложным эфиром полиоксиэтиленгликоля, и дезинтегратором - этиловым эфиром, отделения водной фазы и удаления изнее остатков этилового эфира (11.Однако известный способ является трудоемким и не обеспечивает полного освобождения скрытых гемагглютининов.Целью изобретения является повышениевыхода гемап лютпнинов.Это достигается тем, что используют простые эфиры полиоксиэтиленгликоля - смесьполиоксиэтиленгликолевых эфиров цетилстеаринового спирта в виде водного раствора илисуспензии в этиловом эфире,При этом для обработки вируссодержащейжидкости этиловый эфир берут в количестве1/4 - 1/9 от объема вируссодержащей жидкости,Способ осуществляют следующим образом.Берут емкость с виру ссодержащей жидкостью, последовательно добавляют туда простой полиоксиэтиленгликолевый эфир (например, смесь полиоксиэтиленгликолевых эфировцетилстеаринового спирта - оксанол ЦС)в виде водного раствора и этиловый эфир или суспензию простого полиоксиэтиленглпколевого эфира в этиловом эфире. Конечная концентрация полиоксиэтиленгликолевого эфира в смеси составляет от 0,02 до 0,5%, объем5 вводимого этилового эфира - от 1/4 до 1/9объема обрабатываемой внруссодсржа щей жидкости. Затем смесь встряхивают 15 - б 0 мин и центрифугируют 20 мин при 3000 об/ мин для разделения водной и эфирной фаз 10 смеси. Водную фазу отделяют от этиловогоэфира и оставляют ее для удаления остатков этилового эфира на 12 - 24 час прп 4"С для парагриппозного вируса 2-го типа, русо гриппа и кори, а для других врусо 1115 оматпой температуре (18 - -20 С) .П р и м е р 1. 11 олучснпе гсмагглютшипопарагрпппозного вируса 3-го типа путем обработки впруссодержащей жидкости водным раствором смеси полиоксиэтиленглпколевых 20 эфиров цетилстеаринового спирта (оксанолЦС) и этиловым эфиром.К 4 мл жидкости, содержащей парагрпппозный вирус 3-го типа (штамм У 2 - 932) с гемагглютинирующим титром 1:4, добавля ют 0,08 мл 1%-ного водного раствора оксанола ЦС(конечная концентрация оксанола ЦС0,02% ). Пробирку встряхивают в шуттель-аппарате 30 сек, добавляют 2 мл этилового эфира и продолжают встряхиваЗо нпе в течение 45 мпн, Затем пробирку цент 5858473рнфугйруют в течение 30 мнн прп3000 об/мип для разделения водной и эфирной фаз смеси. Отделяют водную фазу отэфирной и выдерживают ее при 18 С в течение 24 час для удаления остатков этиловогоэфира. Титр гсмагглютинипов в полученномтаким способом препарате равен 1: 256, кратность прироста гемагглютинирующих титровв сравнении с исходным 64, что в 2 раза превышает выход гемагглютннннов по сравнениюс известным способом.Пример 2. Оптимальный вариант способаполучения вирусных гемагглютининов с применением суспензин оксанола ЦСв этиловом эфире (с одновременным введением детсргента и дезинтегратора).К 4 мл жидкости, содержащей парагриппозный вирус 1-го типа (штамм НЛ 2-61) сгемагглютинирующим титром 1; 2, добавляют1 мл 0,5 -ной суспензип оксанола ЦСвэтнлоиом эфире (конечная концентрация оксанола 0,17 с, объем этилового эфира составляет 1/4 обьсма обрабатываемой вируссодсржащсй жидкости), Смесь встряхивают10 сек вручную и ч 5 мин в шуттсль-аппарате.Затем пробирку цснгрнфугируют 20 мин прн3000 об/мин для разделения водной и эфирной фаз смеси. Водную фазу отделяют отэфирной и выдерживают ее прн 18 С в течение 20 час для удаления остатков этиловогоэфира. Титр гемагглютининов в полученномтаким способом препарате равен 1: 2048,кратность прироста титров в сравнении с исходным 1024, что в 64 раза превышает выходгемагглютннинов по сравнению с известнымспособом,11 р и м е р 3. Оптимальный вариант способаполучения гемагглютининов вируса группы Лпутем обработки вируссодержащей аллантоисной жидкости суспензией оксанола ЦС на этиловом эфире (с одномоментным введением детергента и дезинтегратора).Берут 8 мл вируссодержащей аллантоисной жидкости (штамм вируса гриппа Л/Лнглия42/72) с исходным титром гемагглютининов1: 128, Добавляют 2 мл 0,1-ной суспензииоксанола ЦСв этиловом эфире (конечнаяконцентрация оксанола ЦСв смеси 0,02 "/в,объем этилового эфира составляет 1/4 объемавнруссодержащей аллантоисной жидкости).Смесь встряхивают вручную 10 сек и продолжают встряхивание в шуттель-аппарате30 мин. Затем пробирку центрнфугируют втечение 20 мнп нри 3000 об/мин для разделения водной и эфирной фаз смеси. Отделяютводную фазу от эфирной. Пробирку с воднойфазой закрывают ватной пробкой и помещают в холодильник (4 С) па 20 час для удаления остатков этилового эфира, а затем определяют титр гемагглютининов, который равен1: 1024. Кратность прироста титров в сравнении с исходным равна 8,Одновременно проводят обработку той жсвируссодержащей аллантоисной жидкостиизвестным способом, В этом случае титры 15 20 9 д 30 35 40 45 50 55 ьо 65 гемагглютипипов после обработки составляют менее 1; 2, Следовательно, в данном примере, известный способ не обладает демаскирующими свойствами в отношении гемагглютпнинов вируса гриппа Л, а, наоборот, инактивирует их.П р и м е р 4. Получение гемагглютинина вируса кори путем обработки коревого диагностикума суспензией оксанола ЦСна этиловом эфире (с одновременным введением детсргента и дсзинтегратора). Берут 18 мл коревого диагностикума с исходным титром гемагглютининов 1:2. Добавляют 2 мл 0,2/о-ной суспензии оксанола ЦС в этиловом эфире (конечная концентрация оксанола ЦСв смеси с коревым диагностикумом равна 0,027 о, обьем этилового эфира составляет 1/9 объема внруссодержащей обрабатываемой жидкости). Смесь встряхивают для псрсмсшнвания жидкостей в течение 10 сск и продолжают встряхивание в сосуде, помещенном в лед, в течение 15 мин, Затем пробирку цснтрифугнруют в течение 20 мин при 3000 об/мин для разделения водной и эфирной фаз смеси. Отделяют водную фазу от эфирной. Сосуд с водной фазой помещают в холодильник прн 4 С на 12 час для удаления остатков этилового эфира, а затем определяют титр гемагглютининов. Титр гемагглютининов равен 1: 8. Кратность прироста титров РГЛ в сравнении с исходным равна 4, что не менее эффективно, чем по известному способу (по Хогг бу Е, Ргос, Ьос, Ехр 11, В 1 о 1. Мес 1 1962, 111, 3, с. 814 - 818),П р и мер 5. Получение гемагглютинина парагриппозного вируса 2-го типа путем обработки вируссодсржащей жидкости суспензией оксанола ЦСна этиловом эфире и дополнительным введением этилового эфира на втором этапе.Матрас с культуральной жидкостью, содержащей парагриппозный вирус 2-го типа (штамм ПГ 2-7-931), подвергают трехкратному замораживанию и оттаивани;о при минус 21 - 18 С. Определяют исходный титр гемагглютинипов. Они имеются только в цельной исходной вируссодержащей жидкости. В пробирку переносят 4 мл вируссодержащей жидкости и добавляют 1 мл 0,375/ц-ной суспенции оксанола ЦСв этиловом эфире (конечная концентрация оксанола ЦСв смеси с вируссодержащей жидкостью 0,075/,).Смесь встряхивают для перемешивания жидкостей в течение 10 сек, добавляют 1 мл этилового эфира и продолжают встряхивание в шуттсль-аппарате в течение 30 мин при 3000 об/мин для разделения водной и эфирной фаз смеси. Отделяют водную фазу от эфирной и выдерживают ее при 4 С в течение 24 час для удаления остатков этилового эфира. Определяют титр гемагглютининов вирус- содержащей жидкости. Титр гемагглютининов равен 64. Кратность прироста титра гемагглютининов в сравнении с исходным равна585847 Формула изобретения Составитель Г. Смирнова Редактор М, Дмитриева Техред Л, Гладкова Корректоры; Н. федорова и Л. ОрловаПодписное Заказ 2712/1 О Изд. ЛЬ 990 Тираж 693 НПО Государственного комитета Совета Министров СССР по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж, Раушская наб д. 4/5Типография, пр. Сапунова, 2 64, что в 4 раза превышает выход гемагглютининов по сравнению с известным способом,1. Способ получения вирусных гемагглютининов путем обработки вируссодержащей жидкости детергентом и этиловым эфиром, отделения водной фазы и удаления остатков этилового эфира, отличающийся тем, что, с целью повышения выхода гемагглютининов, в качестве детергента используют смесь полиоксиэтиленгликолевых эфиров цетилстеаринового спирта.2. Способ по п. 1, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что для обработки вируссодержащей жидкости этиловый эфир берут в количестве 1/4 - 1/9 от объема вируссодержащей жидкости,Источники информации,принятые во внимание при экспертизе1. Вопросы производства вакцин и сывороток, т. 2, Киев, 1968, с. 11 - 13.