Способ получения сорбента

СОЮЗ СОВЕТСКИХииииииииие сии иРЕСПУБЛИК(5 п А 61 К 39/ ОПИСАН К АВТОРСКОМ ИЗ бр ог ий кт до ес нов С.П.я сириппастеке ублик. 3. Реглам ны гриппозно инактивирова ст. б, опер. ником Главно водству бакт паратов Мини ния СССР, 19 нт произво хроматог ной жидкой 26, утвер накцикой дства в рафичес 9 124 жд. нача ия по и ирусных равоохрь о управлерийных итерства з1,роиз- пре- ане ГОСУДАРСТ 8 ЕННЫЙ КОМИТЕТ СССРПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ(71) Ленинградский ордена Оской Революции и ордена ТруКрасного Знамени технологичинститут им.Ленсовета(56). 1.Мгедлишвили Б.В., ЖдаБреслер С.Е. и др. Жидкостнатовая хроматография вируса гна модифицированных пористыхлах. Труды Института им.Паст1976, с. 47,43.2. Патент Великобритании9 1346631, кл. С 07 6 7/02, о1975.(54)(57) 1.СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ СОРБЕНТА для выделения и очистки вирусов гриппа путем модификации пористого стекла, о т л и ч а ю щ и й с я тем что, с целью повышения стабильности сорбента и обеспечения возможности повышения выхода и удельной активности вируса, модификацию осуществляют трех-четырехкратной обработкой пористого стекла парами ТС 1 при 160-180 С в течение 100-120 мин и гидролизом продукта парами воды после каждой стадии с последующей обработкой полученного продукта раствором овальбумина.2. Способ по п.1, о т л и ч а щ и й с я тем, что используют раствор овальбумнна при общем содержании последнего 150+10 мг в расчете на 1 г сорбента.Изобретение относится к медицинской промышленности и касаетсяпроизводства сорбентов для очистки вирусов гриппа методом гель-хроматографии.Наиболее распространенным методом для выделения и очистки вирусов гриппа из вирусосодержащей жидкости являетсл метод эксклюзионной (гель- хроматограФии) хроматографии с применением сорбентов на основе порис того стекла. При этом сорбент дол" жен обладать минимальной сорбционной емкостью по отношению к вирусам гриппа и сопутствующим белкам.Метоетод основан на разделении вирусов 15 и белков по принципу молекулярных сил, Отсутствие активных центров на поверхности сорбента исключает возможность сорбции белков или вирусов, что, в свою очередь, позволяет наиболее полно выделить вирусы гриппаго и отделить их от белка. Сорбент, используемый для гель-хроматограФии должен обладать стабильностью, исключающей попадание модификатора в целевой продукт, механическими25 свойствами, позволяющими Фильтровать и наполнять колонку, быть нечувствительным к микробному воздействию и к изменениям рН.Известен способ получения сорбента для выделения и очистки вирусов гриппа путем модифицирования макропористых стекол компонентамналлантоисной жидкости Ц .Недостатком этого способа являет ся нестабильность получаемого сорбента вследствие того, что процесс модифицирования является нестабильным, зависящим от принципиальной нестабильности различных параметров 40 вирусосодержащей аллантоисной жидкости (ВАЖ). 1 В результате полученный сорбент не требует повторного модифицирова Кроме того, модифицированные стекла можно стерилизовать только химически (формалином), а выход вируса достигается в жестких условиях по рН и Концентрации 8 аС 1.Известен также способ получения .сорбента путем модификации носителя титаносодержащими группами(2 .Недостатком этого способа является то, что получаемый сорбент обладает большой сорбционной емкостью к белку и использование водных растворов для модификации (пропитка) не позводяет получить необходи- мое число и расположение слоев, т.е. требуемую структуру сорбента. В результате этого не обеспечивается воспроизводимости результатов при вы- бО делении вируса гриппа.Наиболее близким к изобретению по технической сущности является способ получения дорбеита для выделения и очистки вируса гриппа путем модифи кации пористого стекла поливиннл пирролидоном (ПВП).Процесс обычно проводят в водномрастворе в статических условиях,после адсорбции пористое стекло с модификатором отмывают дистиллированной водой и подвергают термообработке. Использование полученного сорбента позволяет выделять вирус гриппав занисимости от используемого штамма на 16-48 (выход вируса) при удельной активности 0,36-1,41 (отношениетитра вируса к содержанию белка впике). Этот сорбент в настоящее время широко используется в медицинскойпромышленности 13(.Недостатками известного способаявляются непрочная модификация стек" ла, что приводит к сползанию модификатора с поверхности носителя и попаданию в целевой продукт, необходимость повторного модифицированияорбента полининилпирролидоном через-10 хроматографических циклов (через 3 мес.), что является нетехнологичным, а также низкий выход вирусов гриппа при низкой степени его очист ки, высокая стоимость ПВП и длитель. ность процесса модификации носителя.Целью изобретения является повышение стабильности сорбевта и обеспечение возможности повышения выхода и удельной активности вируса при выделении.Постанленная цель достигается тем, что согласно способу.получения сорбента для выделения и очистки вирусов гриппа путем модификации пористого стекла, модификацию осуществляют трех-четырех кратной обработкой пористого стекла парами Т 1 С 1 при 160-180 ОС в течение 100-120 мин и гидролизом продукта парами воды после каждой стадии с последующей обработкой полученного продукта раствором овальбумина.Кроме того используют раствор овальбумина при общем содержании последнего 150110 мг в расчете на 1 г сорбента.Технология получения сорбента для очистки вирусов гриппа состоит в попеременной обработке носителя - пористого стекла с размером пор 2000 А, удельной понерхностью 25 м /г парами четыреххлористого титана и воды при Ф 160-180 С три-четыре раза и обработке.титансодержащего:, сорбента раствором овальбумииа.Такая обработка приводит к созданию на поверхности пористого стекла титансодержащих групп, связанных с поверхностью прочными ковалевтными связями заданного состава истроения.ния (количество титана на сорбентепосле 200 хроматографических циклов оставалось практически равным исходномусодержанию - 0,24 мг экв/г для трехкратной обработки и 0,30 мг экв/г для четырехкратной: обработки). При . этом модификация титан-оксидными группами приводит к снижению растворимости стекла и выходу кремния в раствор с 0,05 мг/мл без модификации до 0,005 мг/мл после. Обработку овальбумином проводят путем сорбции из раствора в емкостях на 100 мл при : 4 фС, Полученный сорбент отмывают:от белка фоновым буфером. Обработка овальбумином сорбентов с тремя и четырьмя слоями гидроксидных групп приводит к практически полному взаимодействию активных центров поверхности сорбентов с белком (85-95). Отмывка белка фосфатным фоновьак буфером рН 7,2 с 0,15 М ЙаС 1, а также десорбция белка буферными растворами рН 2,2-9,0 с ионной силой с 0,15 " 1,5 М НаС 1 не приводит к снятию белка, т.а. озальбуминвязан с поверхностью прочнымиимическими связями, при этом увеличениеили снижение количества циклов модифицирования (один, два, пять, шесть) при обработке овальбумином снижает количество химически сорбированного белка до 50, что, в свою очередь, освобождает активные центры поверхности.Выбранный интервал температур 160-180 С обработки носителя парами четыреххлористого титана обусловлен тем, что при этой температуре поверх ность стекла наиболее гидроксилирована. Увеличение температуры приводит к дегидратации ОН-групп на поверхности, а следовательно, к снижению количества, вступивших з реакцию с Т С 1 гидроксилов, т. е. уменьшению модификатора в поверхностном слое и снижению активности.Уменьшение температуры обработки приводит к замедлению взаимодействия Т 1 С 4 с гидроксильными группами а также не исключает возможности присутствня молекулярно-связанной воды, которая при взаимодействии с Т 1 С может привести к частичному . нековалентному связыванию модификатора с поверхностью носителя, т.е. снижению устойчивости сорбента. Выбранное время обработки носителя парами ТС 91100-120 мин обусловлено тем, что 100 мин это то время, при котором все гидроксильные группы поверхности вступают во взаимодействие с парами Т 1 С 1 . Увеличение времени обработки выше 120 мин не целесообразно, так как поступающие пары, не реагируя, выводятся иэ реактора. Уменьшение времени контакта10 снижает количество модификатора вповерхностном слое, что, в своюочередь, снижает количество активныхцентров, вступающих в реакцию с овальбумином.Таким образом, необходимость трехчетырехкратного модифицированияобусловлена тем, что увеличение илиснижение количества циклов модифицирования при обработке овальбумином снижает количество химическисорбированного белка до 50. При этом освобождаются активные центры поверхности, вступающие во взаимодействие с белком или вирусом при 15 гель-хроматографии, что являетсянедопустимьм.П р и м е р 1. Навеску пористогостекла в количестве 1 г с размеромпор 2000 К, очищенного от примесейи высушенного при температуре около180 С, обрабатывают парами четыреххлористого титана в течение 100 минпри 160 С в реакторе проточного типа в токе воздуха. Затем удаляют 25 пары ТС 1) и образовавшегося хлористого водорода и проводят гидролизпарами воды. Такую обработку проводят три раза.Количество титан-оксидных групп0,24 мг.экв/г. Далее проводят сорбцию овальбумина в емкостях на 100мл при 4 ОС с концентрацией овальбумина 2 мг/мл.Полученный сорбент промывают фосфатным буфером рН 7,2. Емкость сорЗ 5 бента по овальбумину 100 мг/мл.Химическая сорбция белка овальбумина85.П р иЪи Г р 2. Аналогично примеру 1, но обработку парами четырех хлористого титана проводят 120 мин.Количество титан-оксидных групп0,25 мг экв/г. Емкость сорбента поовальбумину 108 мг/мл. Химическаясорбция овальбумина 87,4.45 П Р н м е р 3. Аналогично примеру 1, но обработку парами Т(С 1проводят при 1 180 С. Количествотитан-оксидных групп 0,23 мг экв/г.Емкость сорбента по овальбумину105 мг экв/г. Химическая сорбцияовальбумина 86.П р и м е р 4. Аналогично примеру 1, но модификацию проводятчетыре раза. Количество титан-оксидных групп 0,30 мг экз/г. Емкостьсорбента по овальбумину 120 мг/г.Химическая сорбция овальбумина 95.П р и м е р 5. Навеску пористого стекла с размером пор 2000 А в1 г очищенного от примесей и выУо60 сушенного при 1 180 , обрабатывают парами Т( С 14 в течение 100 минпри т 180 в реакторе проточноготипа в токе воздуха. Затем удаляютпары ТО 4 и образовавшегося хлористого водорода и проводят гидро1124977 Таблица 1 бе ирован- ом 34 1:328 о, модифициролоем титанарезультате одаботки) и оваль Пористое стеклванное одним с,09 лиз парами воды. Такую обработкупроводят четыре раза. Количествотитан-оксидных групп 0,31 мг экв/г.Емкость сорбента по овальбумину118 мг/г. Химическая сорбция овальбумина 93,6. 5Гель-хроматографию проводят наколонке с диаметром 0,44 см, пло,щадью поперечного сечения 0,16 см,высотой слоя сЬрбента 14-15 см,объем сорбента 2,2-2,4 мл при скорости элюции 100 мл/ч см . В качестве элюирующего буфера используютфоновый буфер, т,е. 0,1 М фосфатный буФер рН 7,2 на 0,15 М Й аС 1.На колонку наносят вирусосодержащую аллантоисную жидкость в объеме0,1 мл (4-5 Ъ от объема колонки).Запись хроматограммы проводят наприборе РЭППСМ.ЭфФективность выделения и очистки вируса оценивают по выходу вируса и величине удельной активности(отношение титра вируса к содержанию белка в пике).В работе используют штаммы вирУсов гриппа Х-Ленинград/Н г И(табл.1), А (УФА(Н 1 Б, )(табл.2),А(Н)Ю)(,табл.3). Опыты поочистке вирусов гриппа проводят насорбентах на основе пористого стекла и модификаторов окиси титана(при различном количестве цикловЬодифицирования) и овальбумина.Для сравнения испытаны сорбентына основе пористого стекла и.модификатора поливинилпирролидона.Результаты представлены в табл.1-3.Иэ приведенных данных видно, чтомодификация пористого стекла титан 40 Пористое стекло, модиное поливинилпирролид(известного) оксиднпгли группами и свальбуминомнезависимо от применяемых штаммоввируса приводит к значительномуувеличению выхода вируса по сравнению с известным. При этом резкосокращается количество белка в вирусном пике, т.е. повышается степень очистки вируса (удельная активность), Оптимальными свойствамиобладают сорбенты, полученные в результате трех-четырехкратного модифицирования .пористого стекла титансксидными группами и овальбуми-ном. Таким образом, способ получения сорбента для выделения и очистки вирусов гриппа, заключающийся в модификации пористого стекла парами ТС 14 при 160-180 С в течение 100-120 глин с последующим гидролизом продукта парами воды, причем процесс модифицирования повторяют три-четыре раза, и обработке овальбумином, позволяет создать сорбент, который на стадии гель-хроматографии повышает эффективность вьщеления вирусов гриппа независимо от используемого штамма вируса примерно в два раза при увеличении удельной активности в четыре-девять разСорбент, полученный по предлагаемому способу, устойчив, не требует повторного модифицирования. Тем самым, увеличивая срок, службы сорбента и снижая затраты на его получение, исключается переход модификатора с поверхности, а также ионов кремния в целевой продукт, что упрощает технологию получения вак- цина1124977 Продолжение табл. 1 Пористое стекло, модифицированное двумя слоями титана(полученное в результате двухциклов обработки) и овальбумином. 0,18 1;328 16,0 313 1,48 Пористое стекло, модифицированное тремя слоями титана(полученное в результатетрех циклов обработки) иовальбумином. 0,24 1:656 32,0 170 3,86 Пористое стекло, модифицированное четырьмя слоями титана (полученное в результате четырех циклов обработки) и овальбумином. 0,30 1 р 656 32,0 183 3,58 Пористое стекло, модифицированное пятью слоями титана(полученное в результатепяти циклов обработки) иовальбумином. 0,46 1:328 .16,0 337 0,97 Пористое стекло,модифицированное шестью слоями титана(полученное в результате шести циклов обработки) иовальбумином. 0,60 1:328 16,0 338 0,97,П р и м е ч а н и е. Исходный титр 12048. В табл. 1-3 титр вируса является среднеарифметической величиной, рассчитаннойиэ нескольких опытов. Таблица 2 орбент Пористое стекло, модифванное поливинилпиррол,09 Пористое стеванное однимодифиц титан льтате ки) и,09 Пористое стекло, модифицированное двумя слоями титана .(полученное. в результате двухциклов обработки) и овальбумином. Пористое стекло, модифицированное тремя слоями титана(полученное в результатетрех циклов обработки) иовальбумином Пористое стекло, модифицированное четырьмя слоями ти-.тана (полученное в результате четырех циклов обработки)и овальбумином. Пористое стекло, модифицированное пятью слоями титана(полученное в результатепяти циклов обработки) иовальбумином. Пористое стекло, модифицированное шестью слоями титана(полученное в результатешести циклов обработки) иовальбумином. П р и м е ч а н н е. Исходный титр 1:256. Пористое стекло, модифициро ванное поливинилпирролндоно(известный) Пористое стекло, модифицированное одним слоем титана(полученное в результате одного цикла обработки) и овабумином. 1:144 56,0 194 0,74 1:212 83,0 76 2,80 1 з 130 51,0 180 0,70 1:,146. 57,0 162 0,9012 1124977 е табл. 3 Пористое стекло, модифнцированное двумя слоями титана,18 1:51 Пористое стекло, модифицированное тремя слоями титана(полученное в результате .трех циклов обработки) иовальбумином. 1;768 75,0 87,5 8 О, 24. й 748 73,0 60,0 12 30 Пористое стекло, модифицированное пятью слоями титана(полученное в результате пяти циклов обработки) новальбумином.,78 1:512 50,0 1 Пористое стекло, модифицированное шестью слоями титана(полученное в результатешести циклов обработки) иовальбумином. 0,60 9584 57,0 150 Исходный титр 1:1024. р и м е ч.а н Составитель О.СкородумовРедактор .О.Черниченко Техред Т. Маточка 323/5 Тиран ВНИИПИ Государственного . по делам изобретений 13035, Москва, Ж, Ра ак илиал ППП ффПатент, г,уигород, ул.Проектная Пористое стекло, ванное четырьмя тана (полученное те четырех цикло и овальбумином. модифицирослоями тив результав обработки) 687комитета СССРи открытийушская наб., д.4/5 орректор В.СиницкаяЕВЮ 4 еа одписное