Способ получения тиофосфатных аналогов нуклеозид-ди-или трифосфатов

р 1 437288 ОПИСАНИЕИЗОБРЕТЕНИЯК ПАТЕНТУ Союз Советских Социалистических Республик(33) ФРГОпубликовано 25.07.74, Бюллетень2 осударственный комитетСовета Министров СССРпо делам иэооретенийн открытий(088.8) ата опубликования описания 26.12.7 2) Авторы изобретени Иностранцы фриц Екштейн(Великобритания) Иностранная фирма Макс-Планк-Гезельшафт цур фердерунг дер Виссенш71) Заявитель тен е.В. 4) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ТИОФОСФАТНЫХ АНАЛОГОВ НУКЛЕОЗИД-ДИ- ИЛИ -ТРИфОСФАТОВ-З - Р - О, (П)ОН 10 где К - группа 11ХНе - С - СН-СН ыйот слением известв виде В - РО - (РО ) олярнотом по- в реакслучае ифенилый подв которои В - природноеванное нуклеиновое основани Х - водород или окоигрупп тпи п - 1 или 2,юди иц Изобретение относится к способу полученияновых соединений, которые могут найти применение для биохимических исследований,Известен способ получения нуклеозид-диили-трифосфатов взаимодействием нуклеозид 5-моно-или-дифосфата с фосфорной кислотойи карбодиимидом в присутствии третичногоамина,Применение известного способа привело кполучению новых соединений, обладающихценными свойствами при ферментативных превращениях,Предлагается способ получения тиофосфатных аналогов нуклеозид-ди- или -трифосфатовобщей формулы ающийся в том, что нуклеозид- -дифосфат подвергают взаимодейстхлорангидридом дифенилфосф орной и с соединением общей формулы или НРО - , - Ь - ,с последующим отщеплением групп продукта реакции и возможным оки до дисульфида. Продукты выделяют ным способом в свободном виде или соли,Реакцию ароводят обычно в среде п го органического растворителя, При э рядок введения реагирующих веществ цию устанавливают пробой. В этом возможно сначала получение Р (1) -д Р (2) -нуклеозид-пирофосфата, котор3вергают обработке с 5-2-карбамоилэтилфосфатом в среде полярного органического растворителя с последующим омылением в щелочной среде и возможным окислением до дисульфида, Или Р(1) -дифенил-Р (2) -нуклеозид-пирофосфат подвергают взаимодействию с солью дитиофосфорной кислоты в среде полярного растворителя с последующим восстановлением меркаптопроизводным и возможным окислением до дисульфида, Или Я-карбамоилтиофосфат подвергают обработкехлорангидридом дифенилфосфорной кислоты и полученный продукт реакции приводят во взаимодействие с нуклеозид-дифосфатом с последующим омылением в щелочной среде и возможным окислением до дисульфида,В качестве полярного органического растворителя обычно берут пиридин.Как правило, реакцию ведут при 0 - 100 С, предпочтительно при комнатной температуре.Отщепление группы К от целевого продукта проводят обычно щелочным омылением при нагревании в случае карбамоилэтильной группы или путем восстановления меркаптопроизводным, обычно р-меркаптоэтанолом, в случае тиофосфорнокислой группы.При этом исходные соединения, содержащие фосфорнокислые группы, вводят либо в свободной форме, используя полярные органические растворители, образующие соли, либо в виде их солей, растворимых в органических растворителях, предпочтительно в виде солей с третичными аминами.Окисление целевого продукта до дисульфида, как правило, проводят красной кровяной солью или разбавленной перекисью водорода.В формуле 1-В- в случае, если это натуральное нуклеиновое основание, представляет аденин, гуанин, гипоксантин, цитозин, урацил, тимин, 5-метилцитозин или 5-оксиметилцитозин. В случае, когда Х - оксигруппа - это производные нормальных ,нуклеотидов, а в случае, когда Х - водород, то это соответствующие дезоксирибонуклеотиды.Представителями соединений, полученных по предлагаемому способу, являются аденозин-0- (2-тиодифосфат), гуанозин-0- (2-тиодифат), инозин-0- (2-тиодифосфат), цитидин-0- (2-тидифосфат), уридин-0- (2-тиодифосфат), тимидин-0- (2-тиодифосфат), 5-метилцитидин-0- (2-тиодифосфат), 5-оксиметилцитидин-0- (2-тиодифосфат), аденозин-0- (2-тиодифосфат) -дисульфид, гуанозин- 0- (2-тиодифосфат) -дисульфид, инозин-0- (2- тиодифосф ат) -дисульфид, цитидин-0- (2-тиодифосфат) -дисульфид, уридин-0- (2-диодисульфат) -дисульфид, тимидин-0- (2-тиодифосфат) -дисульфид, аденин-0- (3-тиотрифосфат), гуанозин-0- (З-тиотрифосфат), инозин-0- (З-тиотрифосфат), цитидин-0- (3-тиотрифосфат), уридин-0- (З-тиотрифосфат), тимидин-0- (З-тиотрифосфат), аденин-0- (3- тиотрифосфат) -дисульфид, инозин-0- (3-тиотрифосфат) -дисульфид, цитидин-0- (3-тио 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 4трифосфат) -дисульфид, уридин-0- (3-тиотрифосфат) -дисульфид.В случае, когда В в приведенной формуле представляет модифицированное нуклеиновое основание, это соединение можно получить заменой одного или нескольких заместителей у ядра природного нуклеинового основания. Так, можно присоединить к пуриновому или пиримидиновому ядру в различных положениях атом галоида, алкилы, замещенные аминогруппы, сульфгидриды.Представителями подобных соединений являются, например 1-метил-, 2-метил- или 7-метиладенин, -гуанин, -гипоксантин, -ксантин; З-метил-, И (4) -метилцитозин; 5-бром-, 5-иод-, 5-хлор-урацил; 8-бром, 8-йод, 8-фторгуанин; И(6)-диметиладенин, 1-диметилаллиладенин, 2-аминопурин, 2-кетопурин, 2-тио- или 4-тиоурацил, оротовая кислота, 1-метил- или З-метилурацил, 5-оксиурацил, 5-гидрометилурацил, моноалкиламино- и диалкиламинопурин и т. п.П р и м е р 1. В 5 мл высушенного метанола и 0,43 мл (1 ммоля) три-н.октиламина вносят 347 мг (1 ммоль) аденозин-фосфата и смесь слегка нагревают для полного растворения, Затем растворитель отгоняют под вакуумом и остаток несколько раз упаривают досуха с аликвотным количеством по 5 мл сухого диметилформамида. Затем приливают 7 мл сухого диоксана,и, если не происходит растворения, - 1 мл сухого диметилформамида, Затем приливают 0,3 мл хлорангидрида дифенилфосфорной кислоты и 0,3 мл три-н.- бутиламина. Образуется белый осадок, который вновь растворяют при перемешивании. После 3 час выдержки растворитель отгоняют и приливают 50 мл сухого эфира. Смесь оставляют на полчаса при 4 и затем декантируют. К остатку приливают 5 мл сухого диоксана и полученную суспензию упаривают досуха. Затем приливают раствор 3-2-карбамоилэтилтиофосфата в виде соли с три-н.бутиламмонием в 6 мл сухого пиридина. Смесь выдерживают 3 часа при комнатной температуре, при этом образуется осадок. Пиридин отгоняют под вакуумом, приливают 80 мл 0,2 н. едкого натра и полученный мутный раствор нагревают в течение 10 мин до 100 С. Охлаждают смесь и нейтрализуют ее нонообменной смолой Мерк 1 (в пиридиниевой форме), обрабатывают 0,5 мл Р-меркаптоэтанола, фильтруют и хроматографируют на ДЕАЕ-целлюлозе с применением линейных градиентов триэтиламмонийбикарбонатного буфера. Продукт элюируют при 0,22 М. Выход достигает 35 в пересчете на аденозин-фосфат. Соединение имеет спектр аденозина Х";, 259 ммкм (е 15 000) .П р и м е р 2, 1 ммоль (302 мг) дикалийдигидродитиофосфата переводят в соль пиридиния пропусканием через ионообменник Мерк 1 в пиридиновой форме, К соли пиридиния добавляют 2 ммоля три-н,бутиламина и5сушат под вакуумом. Продукт обрабатывают 4 мл сухого пиридина и затем вводят в реакцию по описанному в примере 1 способу вместо Я-карбамоилэтилтиофосфата. Получение Р-дифенил-Р-нуклеозида происходит из расчета 0,5 ммоля аденозин-фосфата.После 16 час выдержки при комнатной температуре растворитель отгоняют под вакуумом, остаток растворяют в 20 мл воды, обрабатывают 2 мл (меркаптоэтанола и очищают на ДЕАЕ-целлюлозе описанным в примере 1 способом. Выход 26% в пересчете на аденозин-фосфат. Продукт идентичен полученному в примере 1,Пример 3. 0,5 ммоля литиевой соли 5-2 карбамоилэтилтиофосфорной кислоты переводят, как описано в примере 2, при помощи ионообменника в соль пиридиния и затем переводят при помощи 0,22 мл (0,5 ммоля) три-,н.октиламина в моно- (три-н,октиламмонийную) соль. Продукт растворяют в 3,5 мл сухого диоксана и обрабатывают 0,15 мл хлор- ангидрида дифенилфосфорной кислоты и 0,23 мл три-н.бутиламина, Раствор выдерживают 2 часа при комнатной температуре и затем упаривают под вакуумом. К остатку приливают 10 мл эфира и после кратковременного взбалтывания приливают 20 мл петролейного эфира (перегонка при 40 - 60) и смесь оставляют на полчаса при 4. Декантируют, остаток растворяют в 3 мл сухого диоксана и раствор упаривают под вакуумом. В полученный сироп вносят 0,25 ммоля аденозин-дифосфат - моно-(три-н,октиламмоний) - моно(три-н.бутиламмоний)-ной соли в 3 мл сухого г.иридина и раствор оставляют на 2 часа при комнатной температуре. Растворитель отгоняют под вакуумом, приливают 20 мл 2 н, едкого натра и смесь нагревают 10 мин при 100.После охлаждения раствор нейтрализуют с помощью ионообменника, обрабатывают 0,5 мл Р-меркаптоэтанола, очищают хроматографией на ДЕАЕ-целлюлозе с применением линейного триэтиламмоний - бикарбонатного буфера, рН 7,5 от 0,15 до 0,4 М. Целевой аденозин- 0- (3-тиотрифосфат) элюируют при 0,28 М, Продукт очищают повторной хроматографией на сефадексе ДЕАЕ с концентрацией буфера в интервале 0,35 - 0,6 М (поступающий при 0,5 М). Соединение обнаруживает спектр аденозина Лн,-о, 259 ммкм (е 15 000) .П р и м е р 4. Раствор 1 ммоля, полученногопо описанному в примере 1 способу, аденозин-0- (тиодифосфата) в воде обрабатывают водным раствором красной кровяной соли и оставляют на 5 мин при комнатной температуре. Полученный раствор переносят на хроматографическую бумагу и при рН 7,5 и 2200 В подвергают электрофоретическому разделению. Аденозин-0- (2-тиодифосфат) -дисульфид элюируют смесью равных объемов метанола и воды. Выход 60%. Соединение обнаруживает спектр аденозина Л",- 259 ммкм (е 30 000) .6П р и м е р 5. 6 молей аденозин-0- (2-тиодифосфата) и 0,8 мл воды обрабатывают 0,1 мл 3%-ной перекиси водорода и затем упаривают досуха. К остатку приливают 1 мл воды и упаривают. Операцию проделывают трижды для удаления остатков перекиси водорода.Происходит количественный перевод в дисульфид.П р и м е р 6, Аденозин-0-(3-тиотрифосфат) 10 переводят описанным в примере 4 способомв аденозин-0- (3-тиотрифосфат) -дисульфид.Выход 50%. Спектр аденозина Л"о 259 ммкм (е 30 000).П р и м е р 7. Аденозин- (3-тиотрифосфат)переводят описанным в примере 5 способом в аденозин-0- (3-тиотрифосфат) -дисульфид (т. е. окисляют до дисульфида). Выход 90%.Повторяют описанные в примерах 1 - 7 операции, заменив производное аденозина соответствующим производным гуанозина, инозина, цитидина, уридина, тимидина, 5-метилцитозина или 5-оксиметилцитозина, Аналогичным образом употребляют соответствующие дезоксипроизводные. Во всех случаях реакции протекают с аналогичными выходами. Предмет изобретения 1. Способ получения тиофосфатных аналогов нуклеозид-ди-или-трифосфатов общей фор- мулы Я - РО - (РО) - 0 -0р, (П 1ИН - С - СН-СК где К - груп или 1.1 РОз - 1 - ,с последующим отщпродукта реакции ипродукта, известнымвиде или в виде солисульфида.2. Способ по и. 1, очто процесс проводят65 пичсского растворите еплением группы К от выделением целевого способом в свободном , или окислением до дит л и ч аю щ и й с я тем в среде полярного оргаля, например пиридина 40где В - природное или модифицированногнуклеиновое основание;Х - водород или оксигруппа;ги.и п - 1 или 2,о т л и ч а ю щ и й с я тем, что нуклеозид- моно-или-дифосфат подвергают взаимодействшо с хлорангидридом дифенилфосфорной кислоты и с соединением общей формулы