Способ получения 11, 21-диоксистероидов

555115 Воднорастворимые натриевые соли кислыхэфиров формулы П получают этериАикацией соответствующих 21-оксистероидов органическими и неорганическими кислотами, например янтарной или фосфорной кислотамипо методике 4П р и м е р 1 К суспензии 20 г(0,058 моля) кортексолона в 240 мл теторагидрофурана, охлажденной до -40 С прикапывают раствор 29,2 г (0,16 моля) пирофосфорилхлорида в 40 мл тетрагидрофурааче- на в течение 15 мин. Смесь перемешиваютопри -40 С 3-3,5 часа до исчезновения кортексолона (ТСХ). Затем прикапывают 100 мловоды при температуре не выше 0 С в течение 15 мин. Тетрагидрофуран отгоняют ввакууме, к суспензии приливают 100 мл воды и охлаждают при 5 С в течение часа.Осадок отфильтровывают, промывают водойдо рН 5 и после сушки получают 23,1 г(рвзложение); С + 112 (с = 1;метанол); Е = 359; А 240 нм.Найдено, %: Р 7,37%;Снор.Вычислено, Р 7,26%,20 г 21-фосфата кортексолона растворяоют в 100. мл метанола поои 60 С. К охлажденному раствору при 10 С приливают 2 Яспиртовой раствор едкого натрв до рН 10,Смесь охлаждают при -о С в течение часа.оОсадок отфильтровывают, промывают 20 млсухого хлороформа и 20 мл абсолютногоэтвнолв. После сушки получают 20,5 геро- ЬЬ (92,5 Ъ,)1,Р = К =Н; К, =ОН;ацию %:РО(Ойа 1 д; фЦ + 100 (с=1; дискон- тиллированная вода).Таким образом, выход динвтриевой соли21-фосфата кортексолонв составляет 87%,считая на кортексолон. анные зн е К К имеют я,21 ро- омо К выросшему в виде водногоелию ввля твор. Трвнсфор мицелии пр урапьной ж а 21-оксис осуществляют на ытом центрация стерои ти 3-5 г/л, в пе ядкос- теро 60 счет ляет увеличивать концентрацию стероидов в культуральной жидкости.При обоих методах внесения стероида лишь незначительнаячасть находится в растворенном состоянии (1 О%), что ограни- Ь чивает скорость процесса.Целью изобретения является устранение недостатков известных способов, интенсификация процесса за счет увеличения концентрации стероидов в процессе 11 Д -гидроксили роввния, повышения скорости реакции и упрощение процесса.Для этого производное 21-оксистероида вводят в культуральную жидкость в виде водного раствора натриевых солей кислых 1 Ь эфиров 21-оксистероидов формулы 11 Ы - остаток натриевой соли янтараой или фосфорной кислоты (- СОСНСНСООКаили - Р 0(0 йа) ,Предлагается способ получения 11 Ь-диоксистероидов формулы 1 путем микбиологического гид; оксилирования при иши культуры гриба такого, как Т 1 яфЬегтфИаОУСЫдЬрвыращенного в аэрируемых условиях на питательной среде, содержащей источники углерода, азота и минервльных солей, заключающийся в том, что исходный стероид вводят в виде водного растворанатриевых солей кислых эфиров 21-оксисте-Фроидов формулы П,По предлагаемому способу для процессатрансформации используют культуру ТИЪЮщЕИО огеЪдЮ, Можно также использовать гриб Скетчи 1 ата ипата.Трансформирующую культуру выращивают ваэрируемых условиях на среде, содеркашейуглеводы, органические источники азота инеорганические соли. По окончании процесса трансформациикультуральную жидкость отделяют от мицелия и экстрагируют несмешивающимися сводой растворителями. Растворитель упаривают и целевой продукт выделяют известным способом.Использование для микробиологическогополучения 11 21-диоксистероидов в качестве исходных соединений натриевых солей кислых эфиров 21-оксистероидов позволяет увеличить нагрузку стероида в 6-10рвз по сравнению с известными способамии довести ее до 3-5 г/л (в пересчете на21-оксистероид), за счет чего достигаетсяповышение производительности аппаратуры,упрощение и ускорение процесса производства,П р и м е р 2. Способом, описанным в примере 1, получают 21-фосфат 6-А -фторА, 17 д, -изопропипидендиоксипрегнен-ол-диона,20 1,К = Г, К и- изопропилидендиоксигруппа, Й 4, = РО( ОН)Д с входом 71,5%.Я + 64 с (с = 0,5;СНзОН); Е 3213;3236 нм.Способом, описанным в примере 1, получают динатриевую соль 21-фосфата 6 А - В -фторА, 1 7 дС -изопропилидеьдиоксипрегнен-ол1-диона,20.П р и м е р 3. Суспензию 18 г кортексолона 1, К = К= Н, К = ОН, й, =Н) и 14 г (3 моля) янтарного ангидрида в И 90 мл пиридина в токе аргона перемешивают 10 час. Затем раствор охлаждают и приь0-10 С в течение часа к смеси прибавляют 108 мл соляной кислоты, 90 мл воды и 90 г льда, После этого температуру новы- Зошают до 20 С и перемешивают в течение 3 час. Осадок отфильтровывают, промывают водой и после сушки получают 22,87 г гемисукцината кортексопона ( 1,К = К= Н, Р ОН, К СОСН СН СООН) с т.л. 193- 3.95 С. Выход 95%, на пластинке 3;ЯдфоЦ 07 254 в системе этилацетат/ циклогексан (4;6) при:просматривании в Уф-свете исходное не обнаружено.После перекристалпизации из ацетона т.пл. 195 197 С, ос 1) 1 18,4 ( 1 ю этанопа ).К раствору 1,36 г бикарбоната натрия в 136 мл воды прибавляют 4,52 г гемио сукционата кортексопона (т.пл. 193-195 С); перемешивают в течение 2 час н используют на стадии трансформации.П р и м е р 4. 1 1 Ь -Гидроксилирование динатриевой соли 21-фосфата кортексо- ,р лона при помощи ТеИЕпеИа ощЪдаКультуру гриба Т 1 ефйегпеИд огсЪйь выращивают на скошенном суслоогаре в пробирках в течение 2-3 недель при 26-28 С. Споры гриба смывают с поверхности агара 4 5 мп физиологического раствора и споровую суспензию в количестве 1 мп вносят в 100 мп стерильной среды следующего состава: глюкоза 30 г, кукурузный экстракт, 5 г (сухой вес), пелтон 3 г, дрожжевой 9 автопизат 3 г,КИ Р 04 5 г, вода водопроводная 1000 мп; рН 6,8-7,2, Первый инокулят выращивают в конических колбах емкостью 0,75 л на круговой качалке 220 об/мин при 26-29 С. Через сутки Ж полученный инокупят в количестве 10 мл вносят в 1 50 мп среды названного состава и проводят вторую инокупяцию при том же режиме, что и первую. Через 20-22 часа роста мицеппй от 13 колб отфяпьтрсвыва ют, объединяют, промывают водой (рН 6,57 и ресуспензируют в водопроводной водекомнатной температуры. Полученную воднуюсуспензию мицелия в количестве 1950 млразливают по 150 мл в к нические колбына 0,75 л, доведя предварительно рН до7-7,2. В каждую колбу вносят 450 мгкортексолона (нагрузка 3 г/л) в виде водного раствора динатриевой соли 21-фосфата, для чего навеску соли 7,95 г (соответствующую 5,85 г кортексопона) растворяют предварительно в 65 мл воды. Трансформацию стероида ведут в тех же условиях, что и выращивание мицелия гриба. Контроль процесса осуществляют методом хро-матографии на пластинках 8 ГО.1 О 6 "в системе метанол /хлористый метилен/ вода (5:95:0,5). Продолжительность процесса24-36 час, По окончании процесса трансформации культурвльную жидкость отфильтровывают от мицелия, мицеплй промывают водой,трижды экстрагируют хлороформом (1:1 пообъему). Отгоняют хлороформв вакууме, остаток растирают с 30 мп гексана.Осадокотфильтровывают и сушат. Все суммы стероидов 5,3 г (87%), содержание гидрокортизона 65%,П р и м е р 5. 11 Ь -Гидроксилирование динатриевой соли 21-фосфата кортексолона при помощи СцгчиРсйта Юипс 1 О.А. Культуру гриба С, ка выращивают в пробирке на скошенной агаризованной среде следующего состава: глюкоза 4 г, дрок жевой экстракт 4 г, солодовый экстракт 10 г, агар 30 г, водопроводная вода 100 мп, Время выращивания 7-10 суоток, температура 26-28 С. Споры гриба смывают 5 мп дистиллированной воды и споровую суспензию в количестве 2 мп вносят в 100 мп стерильной среды следующего состава: сахароза 30 г, дрожжевой автолизат 2,5 г, НОНО 2 г (1 Н 4 НР 04, 3 г, К НРО 4 1 г, КС 0,5 г, М 604 вода водопроводная 1000 мл; рН 6,0-6,1.Первый инокулят выращивают в конических колбах емкостью 0,75 и не круговой качалке 160 об/мин при 26-28 С. Через 30 час полученный инокупят в количестве 10 мп вносят в 150 мл среды названного состава и проводят вторую инокупяцию при тех же режимах, что и первую, Через 24 часа роста мицелий используют дпя трансфор мации. Подготовку мицелия для трансформации осуществляют как в примере 4. Для трансформации берут 4,9 г динатриевой соли 2 1-фосфата кортексолона, что соотгетствует 3,6 г кортексопона. Навеску растворяют в 40 мп воды и распределяют в 8 колбах (нагрузка 3 г/и). ПродолжительностьП р и м е р 6. 11 -Гидроксилирование натриевой соли 21-гемисукцината кортексолона при помощи Т%ЪпЕИа отсЪдв.Выращивание культуры Т, о еЬ;д 8 . и"процесс трансформации 136 мл водяногораствора натриевой -.оли 21-гемисукцината(соответствует 3,6 г кортексолона) распределяют в 8 колбах с культурой гриба (нагрузка 3 г/л),Продолжительность опыта 24-36 чПосле обработки (пример 4) получаютЗ,З г (87%) технического гидрокортизонасодержащего около 63% гидрокортизона,ас П р и м е р 7. 11-Гидроксилирование натриевой соли 21-гемисукцината кортексолона при помощи Т 4 ефЬещеИа огеЪдаВыращивание культуры Т, ог оЬд в и процесс трансформации осуществляют по примеру 5. Для трансформации 85 мл водного раствора чатриевой соли 21-гемисукцината, соответствующих 2,25 г кортексолона, распределяют в 5 колбах с культурой гриба. Продолжительность трансформации 24-36 час. После соответствующей обработки получают 2,1 (89; ) технического продукта, содержапего 65"о гидрокортпзона.упроцесса трансформации 24-36 час. Поокончании процесса трансформации культуральную жидкость отфильтровывают от мицелия, дважды промывают по 150 мл воды и4 раза экстрагируют хлористым метиленом(1:1 по объему), Посл отгонки хлористогометилена на роторном испарителе остатокрастирают с 20 мл н-гексана и фильтруют,иа фильтре промывают 20 мл н-гексана,Получают сумму стероидов 3,05 г (81%), 10в которой содержится 62,5% гидрокортизона,Б, Выращивание культуры 0.1 ипоГВои процесс трансформации ведут по прим 6 ру5 А. Для трансформации берут 8,16 г динатриевой соли 21-фосфата кортексолона,что соответствует 6 г кортексолона, навеску растворяют в 80 колбах (нагрузка 5 г/л),Чер .3 26 час опыт заканчивается. Обработка такая же, как в опыте 5 А, 20Получают 3,9 г (70%, считая на трансформироваьный стероид, с учетом возвращенного 21-фосфата кортексолона) суммы стеронинов с 60%-ным содержанием гидрокортизона. ИПосле экстракции кулЬтуральной жидкостихлористым метиленом и выделения стероидов,культуральную жидкость подкисляют до рН 3разбавленной серной кислотой и трижды экстрагируют этилацетатом по 150 мл. Послеотгонки этилацетата 0,8 г 21-фосфата кортексолона.Формула изобретения 1. Способ получения 11 Ь 21-диоксистероидов обшей формулы СН ОНС=О где Р. - атом водорода или фтора;К - атом водорода;К - гидроксильная груп3и Р вместе состапро йилидендиокси группу,путем микробиологического гидроксилирования при помощи культуры гриба такого,как ТеЯЬеееОО о сЬ 1 ЬВ выращенногов аэрируемых условиях на питательной спеде, содержащей источники углерода,азота и минеральных солей, производных21-оксистероидов в растворителе, о т л ич а ю ш и й с я тем, что, с целью интенсификации и упрощения процесса, используютводный раствор натриевых солей кислых эфиров 21-оксистероидов обшей формулы Ц па или Квляют изо СН 0П р и м е р 8. 11-Гидроксилир ванне динатриевой соли 21-фосфата 6- -фторХ, 17-изопропилидендиоксипрегн-ен-ол,20-диона при помощи ТеЬевейа оМЬЫВ.Процесс трансформации ведут по примеру 4. Вколбу вносят 150 мг 6 е(-фтоо- -16 о 6, 17 ос -изопропилидендиоксипрегн- -4-ен-ол,20-диона (нагрузка 1 г/: в виде водного раствора динатриевой соли 21-фосфата.Получают 6 А-фтор-1 7 а,-изопропилидендиоксипрегн-11 Д 21-диол,20-дион с выходом 60-70% по хроматографическому анализу культуральной жидкости.Заказ 412/12 Тираж 572 ПодписноеЦНИИПИ Государственного комитета Совета Министров СССРпо делам изобретений и открытий113035, Москва, Ж, Раушская наб., и, 4/5 филиал ППП Патент", г. Ужгород, ул, Проектная, 4 где й, К и И. имеют указанные значения;Р 4-остаток натриевой соли янтарной или фосфорной кислоты -СОСН СН,СООйа иьи -РООИа),.2, Способ по и. 1, о т л и ч а ю щ и й 5 с я тем, что в качестве гриба используютСцлъибопа Рцвзйа .Источники информации, принятые во вни(10 мание при экспертизе:1, Авторское свидетельство СССР370229, кл. С 12 с, 13/00, 1973 г. 2. Патент США3419470, кл. 260195.51, 1968 г.3. Могильницкий Г. М Кашеенко К. А,Особенности трансформации 21-ацетата ве 1щества, 6 Рейхштейна грибом ТефИещеИа01 сЪ 816.Прикл. биохимия и микробиология",1973 г., вып. 3, т. 9, с. 380. 4,Т, МЮ и др., А рЪоврйотуСаЫол оХВЬето 1 й, СИет. о гц 3 РИаз о. ВиО 1974 гу. 22,7. с. 1439.