Способ получения -галактозидазы

СОЮЗ СОВЕТСНИХСОЦИАЛИСТИЧЕСКИХРЕСПУБЛИК ЗШС 12 Б 9 38 ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССРПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ(46) 30.03.84. Бюл. Р 12 (72) И.В,Виха, С.И.Болудева, Т.А.Касьянова и С.И.Кудрявцев (71) Всесоюзный научно-исследовательский институт биологического приборостроения(56) 1 фРцг 1 ГсаС 1 оп сошроя 1 С 3.оп а Мо 1 есц 1 аг че 1 цЬС оГ СЬе З -8 а 1 асСов базе оГ Еяспег 1 сп 1 а со 11 К.-Юоц па 1 В 1 о 1 .Селеш, 1965,ч.240, У 6, 2468-2577.2. Апеша Р.д. Рцг 1 Г 1 саС 1 оп апс 1 воше ргорегС 1 ея оГ -да 1 асСоя 16 ава Ю,Вас 111 цз яцЬс 111 з. - В 1 осп 1 ш 1 са еС В 1 орЪуз 1 са асСа, 1964, 89, 9 3, 495-502.( 54 ) ( 57 ) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ /3 -3 -ГАЛАКТОЗИДАЗЫ, заключаюшийся в культивировании продуцента вида Вас 111 ця ,цЪС 111 в на питательной среде, разрушении биомассы, осаждении нуклеиновых кислот иЪбесклеточного экстРйкта и выделении целевого продукта путем фракционирования белкового раствора сульфатом аммония, о т л и ч а ющ и й с я тем, что, с целью увеличения удельной активности и выхода -Э-галактозидазы, в качестве продуцента используют штамм Вас 111 цз зцЬС 111 з ИБП, в процессе выделения в растворы добавляют ирны Мпв концентрации 2 10 -1.10 М дитиотреитол в концентрации 210- -1 10 М, Я а после осаждения нуклеиновых кислот фермент стабилизируют пропусканием через ионообменную смолу КБ 51 2.Изобретение относится к способам получения и очистки ферментных препаратов иэ микроорганизмов, а именно к способу получения Ферментного префпарата р -Ь- галактоэидазы (лактазы), ( -П-галактоэид галактогидролазы 5 3.2 1.23 иэ Вас 1111 цв вцм 111 в,Изобретение может быть использовано в микробиологической промышленности для получения иммобилизованной на различных носителях р -Ь-галактози-.)0 дазы и изготовления ферментных электродов, предназначенных для контроля эа использованием углеродов при культивировании микроорганизмов, диагностических иммуноферментных комплек- сов, для получения препаратов, предназначенных для компенсации лактазной недостаточности у взрослых и детей, для гидролиза лактозы и утилизации побочных продуктов молока.Известно получение препарата р-галактоэидазы из специально полученного методами индукции и селекции штамма ЕясЬег 1 сЬ 1 а со 11, включающее осаждение бесклеточного экстракта сульфатом аммония и последующую 25 гельфильтрацию на сефадексе Г)1).Однако Е.со 11 относится к условно патогенным микроорганизмам и поэтому производство препаратов на основе штаммов кишечной палочки неже лательно для микробиологической, медицинской и пищевой промышленности.Наиболее близким по техническойсущности и достигаемому положительному эффекту к предлагаемому явля ется способ получения В -П-галактоэидазы, заключающийся в культивировании продуцента вида Вас 111 ця вцЬг.111 я на питательной среде, разрушении биомассы, осаждении нуклеи новых кислот иэ бесклеточного экстракта и выделении целевого продукта путем Фракционирования белкового раствора сульфатом аммония. Способ включает также стадию фракционирования ацетоном и позволяет привести 20-кратную очистку Фермента, Удельная активность Д -галактоэидазы, изеренная при 50 сС равна 239 Е/мг белка, выход по активности 33, по белку 1,6 250Недостатком данного способа очистки является инактивация фермента в процессе фракционирования сульфатом аммония, .ацетоном, следствием чего является низкий выход галактозидазы 55 и недостаточно высокая удельная активностьЦель изобретения - увеличениеудельной активности и выхода р-галактоэидаэы. 60Поставленная цель достигается тем, что согласно способу полученияД-Р-галактоэидазы, заключающемуся в культивировании продуцента вида Вас 111 цв яцМ 111 в на питательной среде, разрушение биомассы, осаждении нуклеиновых кислот из бесклеточного экстракта и выделении целевого продукта путем фракционирования белкового раствора сульфатом аммония, в качестве продуцента используют штамм Вас 111 ця зцЬ 1111 я ИБП, в процессе выделения в растворы добавляют ионы Мо в концентрации 2 101 10 М и дитиотреитол в концентрации 210-1 10 4 М, а после осаждения нуклеиновых кислот фермент стабилизируют пропусканием через нонообменную смолу КБ 51 2.Сущность предлагаемого способа заключается в том, что при получении ферментного препарата )3-галактозидазы путем культивирования продуцента вида В,яцЬ 111 я на питательной среде, содержащей источники углерода, азота и минеральные соли, разрушения биомассы, центрифугирования гомогената, осаждения из бесклеточного экстракта нуклеиновых кислот и фракционирования белкового раствора сульфатом аммония в качестве продуцента используют штамм В.яцЬг,111 я ИБП, перед выделением галактоэидазы из аммонийно-сульфатной фракции белков фермент стабилизируют пропусканием через ионообменную смолу КБ2 и добавлением на всех последующих стадиях в растворы Мпи дитиотреитола, а выделение осуществляют, проводя последовательно ультра- фильтрацию, хромотографию на ДЭАЗ- целлюлозе и ЛЗАЗ-сефадексе и диализ против ацетатного буфера рН 6,3.Способ осуществляют следующим образом. Культивирование продуцента В, яцЬ 1.11 я ИБПпроводят при 37 С глубинным способом в 20 л фермента на жидкой питательной среде следующего состава, г/л: КНРО 42 Н 20 27; М 504 7 НО 0,4; пентон 1,51 МН 4) 50+ р СаСЙ 2 0 01 р Ее 504 7 Н 20 0,4; дрожжевой экстракт 1; лактоэа 20, лимоннокислый натрий (одно- замещенный ) 1,9, рН 7,2 в течение 20+2 ч. Биомассу отделяют центрифугированием, клетки промывают 0,85-м МаС 1 и ресуспендируют в дистиллированной воде из расчета на 1 г биомассы 2-3 мл воды. Суспензию разрушают ультразвуком и экстрагируют из нее белки 2,3-м раствором )ЧаС 3 при перемешивании в течение нескольких часов при 5 фС, центрифугируют при 15000 об/мин в течение 30 мин. Удельная активность галактозидазы на этой стадии 1,2-1,4 Е/мг белка. Нуклеиновые кислоты осаждают из супернатанта сульфатом аммония при рН 6,8 до достижения степени насыщения 0,25, а супернатант после диализа обрабатывают ионообменной смолой КБ 51 2.60 Использование катионита КБ2для обработки фракции белков иэ кле"ток В,виЬС 111 е приводит к тому, чтобольшая часть портеинаэ удаляетсяиз раствора, а оставшиеся протеиназы удаляются после осаждения )3-галактоэидазы сульфатом аммония.пристепени насыщения 0,75. Удельнаяактивность р -галактозидазы в процессе обработки смолой возрастаетлишь на 30, но удаление протеинаэ 10исключает протеолиз р -галактозидазына всех последующих стадиях очисткии таким образом стабилизирует фермент.К 100 мл раствора сульфатной фрак-.5ции белков прибавляют 1/5 ч. по объему набухшей смолы КБ2 в Ма-форме, уравновешенной 0,05 М фосфатнымбуФером ( рН 6,7 ), и оставляют на 1 чпри 4 ОС при периодическом перемешивании; раствор декантируют и осаждают из него р -галактозидазу сульфатом аммония до степени насыщения0,75Удельная активность протеинаэ дообработки смолой ЗЕ/мг белка, послеобработки смолой и осаждения сульФатом аммония 0,3 Е/мг белка.Удельная активность галактоэидазыдо обработки КБ2 - 1,4 Е/мг белка, после обработки 1,9 Е/мг белка, 30фракцию белков, осажденную сульфатом аммония со степенью насыщения0,75, подвергают ультрафильтрациичерез полупроницаемые ацетатцеллюлозные мембраны типа УАМмарки 35Владипор. На этой стадии получаютпрепарат с удельной активностью7 Е/мг белка, с выходом по белку31,4, по активности 148. Препаратподвергают хромотографии и рехроматографии на ДЭАЭ-целлюлоза, уравновешенной 0,005 М фосфатным буфером,210 - - 110 )М дитиотреитола и2 10 - 1-10 М МАСС (буфер А)Элюцию 8-галактозидазы проводят ли нейным градиентом НаСР 0,05-1 М в бу,фере А. Фермент выходит при концентрации МаСР 0,25-0,45. Активныефракции концентрируют и диализуютпротив буфера А.50Удельная активность р -галактозй- .даэы на этой стадии 23,4 Е/мг белка,выход по белку 12,1, по общей активности 190.Рехроматографию на ДЭАЭ-целлюлозепроводят в тех же условиях и получают препарат с удельной активностью198 Е/мг белка, выходом по белку 8,6и 220 по активности.Препарат подвергают хроматографии на ДЭАЭ-сефадексе, уравновешенном 0,05 М ацетатным буфером (рН 7,0),содержащим 0,005 М МаСР, 10 +М дитиотреитола и 10М МьСР 2 (буфер Б).Элюцию проводят линейным градиентом 65 МаСР 0,005-0,2 М в буфере Б. Активные фракции диализуют против буфера Б (рН 6,31, получают препарат Р -галактоэидазы с удельной активностью 467 Е/мг белка, выходом по белку 3,0 и 936 по активности. Препарат-галактоэидаэы можно хранить беэ потери активности в 2,2 М Растворе сульфата аммония ( рН 6,3 ).Активность ) -галактоэидазы определяют с и -нитрофенил-р-Ю-галактопираноэидом в качестве субстрата. За единицу активности (Е) принимают такое количество фермента, которое каталиэирует расщепление 1 мкмоль субстрата в минуту при оптимальных условиях.П р и м е р 1. Культивирование продуцента ф .ЯцЬС 1 з ИБПпроводят при 37 ОС глубинным способом в 10-литровом ферменте фирмы КВ на жидкой питательной среде следующего состава, г/л: пептон 1,5; сульфат аммония 4,0; калий фосфорнокислый ,однозамещенный 27,0; магний серно- кислый семиводный 0,4; кальций хлористый 0,01, железо сернокислое семиводное 0,4; натрий лимоннокислый 1,9) дрожжевой экстракт 1,0; лактоза 50, рН 7,1 в течение 20 ч до достижения стационарной фазы.После завершения ферментации клетки отделяют от культуральной жидкости центрифугированием, трижды отмывают 0,85-м МаСР и ресуспендируют в трех объемах дистиллированной воды, содержащей 1 10 "моль ЭДТА ( этилендиаминтетрауксусная кислота ), и гомогенизируют.Разрушение клеток ультразвуком проводят на ультразвуковом дезинтеграторе Яопргег=150 фирмы М 5 Е порциями по 70 мл в течение 5 мин, Доводят рН до 7,2 0,5 м фосфатным буфером ( рН 7,8), и экстрагируют белки при перемешивании в течение нескольких часов при 4 С.После центрифугирования при 16 тыс.оборотах в течение 30 мин иэ супернатанта осаждают нуклеиновые кислоты сульфатом аммония до степени насыщения 0,25, поддерживая рН 6,8 ф 1 М БаОН.После "повторного центрифугирования супернатант.обрабатывают ионообменной смолой КБ2 для удаления протеаз. На каждые 100 мл раствора сульфатной фракции белков прибавляют 1/5 ч по объему набухшей смолы КБ 2 в Ма-форме уравновешенной 0,05 М К-Ма-фосфатным буфером ( рН 6,7), и оставляют на 1 ч при 4 фС при периодическом перемешивании. Затем раствор декантируют и осаждают из него )-галактозидаэу сульфатом аммония до степени насыщения 0,75 поддерживая рН 7,2 1 М МаОН. Полученный осадок отделяют центрифугировани 1082812ем при 16-18 тыс. оборотах в течейие 30 мин и растворяют в 0,05 МК-йа -Фосфатном буфере ( рН 7,2 1, содержащем 5 10 М йасин, 1 10-4 М ди, тиотреитола и 210"М МпСР 2,Затем белковый раствор фильтруютчерез полупроницаемые ацетатцеллюлозные мембраны типа УАМмаркиВладипор, до объема 1/3 от исходногос последующей диафильтрацией в шестикратном объеме к исходному 510 МК-Ма-фосфатного буфера (рН 7,4),содержащего 5 10 МаС 0,1 10 4 дитио-треитола, 2.10 " М МпС 1 г (буфер А )до объема 1/3 от первоначального,Полученный препарат подвергаютхроматографии и рехроматографии наДЕАЕ-целлюлозе, уравновешенной буфером А, на колонке 25"300 мм, Элюцию-галактозидазы проводят линейным градиентом ЙаСР 5 10 3 -1 М вбуфере А. Скорость элюции 60 мл/ч,время градиентной элюции 24 ч, фермент выходит при концентрации МаС 10,25-0,45 М. Активные фракции собирают, концентрируют и диалиэуют против буфера А.Рехроматографию на ДЕАЕ-целлюлозе проводят в тех же условиях, нополученные активные фракции концентрируют и диализуют против 0,05 Мацетатного буфера (рН 7,0), содержащего 5 10МаСР , 1 10 4 дитиотреитола и 1 10- м мостил, (буфер Б 1,г-подготавливая к хроматографии наДЕАЕ-сефадексе.Хроматографию на ДЕАЕ-сефадексе,уравновешенном буфером Б, проводятна колонке 12 600 мм. Элюцию ведутлинейным градиентом МаС 5.102 10 " М в буфере Б при скорости30 мл/ч. Активные фракции, выходящие первыми двумя пиками, собирают,концентрируют на полупроницаемоймембране УАМмарки Бладипор илив полиэтиленгликоле мол, массой40000 до концентрации белка 40 мг/мли диализуют против буфера Б (рН 6,3)Препараты р -галактозидазы хранят в 2,2 М растворе сульфата аммония (рН 6,31 с концентрацией белкапримерно 20 мг/мл.Активность р -галактозидазы определяют с и -нитрофенилВ-галактопиранозидом в качестве субстрата. Заединицу активности принимают такоеколичество фермента, которое катализирует расцепление 1 мкмоль субстрата в минуту при температуре 37 С иорН 6,330 35 40 собу, после высаливания сульфатом аммония до степени насыщения0,75 растворяют в 0,05 М К-Йа-фосфатном буфере, содержащем 5 .10МаСО, 2 10 + МССР , 2 10 М дитиотреитола, Активность препарата, полученного на данной стадии при укаэанных концентрациях МлСР и дитиотреитола, равна 13,5 Е/мг, что превышаетудельную активность препарата, полученного при более высоких концентрациях активаторов (табл. 11. Таким образом, предлагаемый способ получения ферментного препарата р-галактозидазы позволяет избежать инактивации фермента в процессе очистки вследствие его стабилизации, а предлагаемая схема очистки позво,ляет повысить удельную активность фермента в два раза по сравнению с 45 лучшими препаратами, увеличить выходпо активности в 30 раз и достигнуть320-кратной очистки. Так как Ферментимеет рН оптимум в широком диапазоне( рН 6-9), препарат может быть применен для приготовления иммобилизованных ферментов с цеЛью последующегоиспользования в практических целях. 50 55 Результаты очистки приведены втабл. 1П р и м е р 2, Препараты В -галактоэидазы, полученйые по вышеописанному способу, но без внесения в раст 5 воры Ме и дитиотреитола, выдерживают в течение 15 мин при 41 С в0,1 М К-Ма-фосфатном буфере рН 6,3 вприсутствии различных солей и 2-меркаптоэтанола и беэ них. Затем инку 0 бируют в тех же условиях в течение10 мин с 1,2 мг субстрата - и -нитрофенил-р-Р-галактопираноэида. По окончании инкубации измеряют активностьФермента,Результаты приведены в табл. 1.Результаты опытов показали, чтодостижение положительного уфекта невозможно без добавления Мп и дитиотреитола,так как полученный Ферментобладает крайне низкой удельной ак20 тивностью (48,6 Е/мг.Добавление к очищенному ферментуионов Мь+ и дитиотреитола или 2-меркаптоэтанола активирует фермент, нопри этом его активность не достигает25 значений, характерных для препарата,полученного при добавлении активаторов в процесое выделения.П р и м е р 3. Преперат р -галактозидазы, полученный по описанному спо% Степень очистки Выход пообщейактивности, % Общийбелок,мг Общая активность,Е Стадия очистки 12100 18162,1 1,49 - 100 100 г 9334 17953,0 1,92 1,3 77,1 98,8Исходный экстрактСмола КБ-.,51 2 Фракция белков 75-гонасыщения сульфатомаммонияУльтрафильтрация,УАМ9200 32328,6 3800 26880,0 2,3 76,0 178,0 4,7 31,4 148,0 3,49 7,0 Хроматография на ДЕАЕцеллюлозе с диализомпротив 0,005 М К-Ма-фосфатного буФера рН 7,4Рехроматография на ДЕАЕцеллюлозе с диализомпротив 0,05 М ацетатногобуФера рй 7,0Хроматография на ДЕАЕ-сефадексе с диализом промив 0,05 М ацетатногобуфера рН 6,3 1470 34508,0 15,7 23,47 12,1 190,0 1040 206880,0 :198,92 133,5 8,6 1139,0 364 170000,0 467,03 313,4 3,0 936,0 Таблица 2Влияние солей, дитиотреитола и 2-меркаптоэтанолана активность -галактозидазы при 41 Со Концентрация,моль.64,8 2-Меркаптоэтанол 1.10 71,3 146,7 Контроль (бездобавок 48,6 100 ВНИИПИ Заказ 1677/24 Тираа 522 Подписное филиал ППП "Патент", г, Уагород, ул.Проектная, 4 МдС 22СаС 12гаБО+Мп 80, 5 НОБаС 1Бгс 1 бн гОСаяс, ВН ОСоС 12 бН 20ДитиотреитолИа 2 БО 10 Н О 208,4 143,4 123,5 150,0 200,0 146,7 133,3