Способ определения липопротеинов низкой плотности в сыворотке крови

СОЮЗ СОВЕТСКИХСОЦИАЛИСТИЧЕСКИХРЕСПУБЛИК 96019 4 С 01 И 33/5 РЕ) .фер (АТ) ПРОТЕИНОВОРОТКЕ спосо- липоЛ соб теин вы" ующуюсяи в нают ЛНП для этой а соглас рме ЛВПОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССРО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ(54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ЛИПОНИЗКОИ ПЛОТНОСТИ (ЛНП) В СЬВКРОВИ(57) Изобретение относится кбу и реактиву. для определенипротеинов низкой плотности (целью является ускорение споисследуемые пробы сывороткидобавляют антитело - липопросокой плотности (ЛВП), образнерастворимую часть отделяютдосадочной жидкости определяили его компоненты обычнымицели методами, ЛНП - антително изобретению используют в фо антисыворотки, в виде обезжиренной ЛВП- антисыворотки, либо в форме очищенных фракций ЛВП-антител. Также применяют фрагменты ЛВП-антител, например ГаЬ-, РаЬ - и РаЬ -фрагмен 2-з10 моль/л. Отделение образовавшихся при добавке ЛВП-антител иммуноагрегатов осуществляют обычными способами. Если используют растворимые ЛВП-антитела, то отделение осуществляют путем центрифугирования. Если используют иммобилизованные, связанные с носителем ЛВП-антитела, то иммуноагрегаты отделяют путем простого отделения жидкой фазы от компактной твердой фазы. В качестве иммуногенов, однако, предпочтительно применяют полностью очищенную ЛВП-фракцию. Очистку ведут путем выделения в ультрацентрифуге. В зависимости от условий дополнительно проводят дальнейшую очистку через иммобилизованный конкавалин А по методам аффинной хроматографии или электрофореза. Антисыворотку получают путем иммунизации овец или кроликов. 3 табл.12960Изобретение относится к способу и реактиву для,определения липопротеинов низкой плотности (ЛНП)Цель изобретения - ускорение способа.Гиперхолестеринемия и гипертриглицеридемия благоприятствуют возникновению атеросклероза и инфаркта сердца. Определение холестерина и тритлицеридов в сыворотке (крови) поэ тому относится к наиболее часто осуществляемому тесту в клинико-химической обычной лаборатории.Способ осуществляют следующим образом. 15В исследуемые пробы добавляют антитело - липопротеин высокой плотности (ЛВП), образующуюся нерастворимую часть отделяют и в надосадочной жид- кости определяют ЛНП или его компоненты.Установлено, что ЛВП-антитела все без исключения осаждают мешающие определению ЛНП липопротеиновые фракции наряду с самим ЛВП, в особенности ЛОНП и хиломикроны, однако, ЛНПФне осаждается, Как ЛНП, так и ЛВП, ЛОНП и хиломикроны содержат долю протеина, которая в свою очередь содержит одинаковые апопротеины, также в З 0 очень различных концентрациях. Антитела к ЛВП количественно осаждают не только ЛВП, но также ЛОНП и хиломикроны, не влияя при этом на ЛНП.Осаждение ЛОНП и хиломикронов мож- З 5 но ускорять использованием дополнительно известных осадителей для этихвеществОстающуюся в надосадочной жидкости реактива ЛНП - фракцию затем 40определяют по обычным для этой цели методам. Связанный холестерин, содержащийся в ней, определяют при применении известных для этой цели способов. Так, например. определяют путем 45 омыпения с помощью спиртового раствора гидроксида калия и химического определения по ЫеЬегшапп-ВцгI сЬагй. Однако предпочтительно осуществляют ферментативное определе ние при использовании холестериноксидазы и расщепляющего холестерин фермента или системы Ферментов, как, в особенности, холестеринэстераза.Приприменении последнего метода опреде ляют потребленный кислород, образовавшийся холестенон или предпочтительно в большинстве случаен обра,"зовавшийся Н О по известному для 19 2этой цели методу Фахманна. Предлагаемым способом путем удаления фракций ЛОНП и хиломикронов предотвращают появление помутнений, которыемешают оптическому измерению количества холестенона или Н О в рамкахйцветных реакций. Поэтому способ пригоден в сочетании с колориметрическими методами определения холестерина,Кроме того, вместо содержащегосяв ЛНП-фракции холестерина или других ЛНП-компонентов, таких как аполипопротеин В, фосфолипиды и триглипериды, определяют ЛНП-фракцию, используя нефелинометрическое определение или турбидиметрическое определение,ЛНП-антитела согласно изобретениюиспользуют либо в форме ЛВП-антисыворотки, в виде обезжиренной ЛВПантисыворотки, либо в Форме очищенных Фракций ЛВП-антител. Также применяют фрагменты ЛВП-антител, напримерФРаЬ-, ЕаЪ - и РаЬ -фрагменты, илиантитела к аполипопротеинам А, Си/или Е ЛВП или его Фрагменты, илимоноклональные ЛВП-антитела.Получение используемых антителосущесЪляют с применением чистогоЛВП или одного из указанных аполипопротеинов в качестве иммуногенов.Для получения антител используюткроликов и овец. Кроме упомянутыхживотных, соответственно сравнимыхживых существ, применяют также культуры клеток. Отделение образовавшихся при до" бавке ЛВП-антител иммуноагрегатов осуществляют обычными способами.Если используют растворимые ЛВП-антитела, то отделение осуществляют путем центрифугирования. Если используют иммобилизованные, связанные с носителем ЛВП-антитела, то иммуноагрегаты отделяют путем простого отделения жидкой фазы от компактной твердой фазы, например твердых тел, покрытых антителами. Если применяют полученные с помощью аполипопротеинов в качестве иммуногена антитела, то используют их,когда применяемый в качестве иммуногена полипопротеин имеет липидную оболочку. Для этого после обычного удаления липидов (делипидирования) и последующего фракционирования аполипопротеинов выбранный аполипопротеин фракции А, С3 12960 и/или Е снова повторно липидируют (релипидируют).В качестве иммуногенов предпочтительно применять полностью очищенную ЛВП-фракцию. Очистку ведут пу тем выделения в ультрацентрифуге. В зависимости от условий дополнительно проводят дальнейшую очистку через иммобилизованный конкавалин А по методам аффинной хроматографии или электрофореза. 19 П р и м е р 1. А. Получение очищенной ЛВП. После отделения ЛОНП и .ЛНП в ультрацентрифуге выделяется 15 узко отобранная ЛВП-фракция (й=1,080- 1210) (Ч,Р. БМрвЕ 1 Ь 1 р 1 й. сошровгСгоп ог 1 лроргоегпв 1.п погша 1 апй йгвеаяей вгагея Ь; В 1 оой ЬгрЫв апй Таблица 1. Введение День 0-й Внутрикожно 7-й То же Внутримьпдечно 14-й Подкожно 30-й Внутримышечно 60-й Подкожно Все следующие30 днейВ 45 стых эфиров жирных спиртов, 400 ед/лхолестеринэстеразы, 250 ед/л холестериноксидазы и 200 ед/л пероксидазы.После инкубирования в течение20 мин при комнатной температуре измеряют экстинкцию пробы по сравнению с холостым значением реактива,(холостое значение реактива содержит 50 мкл антисыворотки и учитыва-ет содержание холестерина в сыворотке).ьЕ = ЬЕ,-аЕ холостое значениереактива ЛНП-холестерина (мг/дл)1,385 х сЕ.В табл. 2 приведены результаты. Первое взятие пробы крови осуществляют спустя 45 дн.В, 50 мкл сыворотки смешивают с 150 мкл приготовленной по п. Б анти- сыворотки. После инкубации в течение 30 мин при комнатной температуре отделяют центрифугированием образовавшийся осадок (2 мин при 10 000 д).50 мкл прозрачной надосадочной жидкости смешивают с 2 мл реактива, который содержит О, 1 моль/л трис-буфера, рН 7,7, 0,05 моль/л аппарата магния, 1 ммоль/л 4-аминофеназона, 6 ммоль/л фенола, 4 ммоль/л 3,4-дихлорфенола, 03% полигликолевых проЬроргогегпв: Яцапг 1 гаггоп Сошроягг 1 оп апй МегаЪо 1 гяш. Нгвя; Ие 1 яопИ 1 еу Нью-йорк 1972, с. 471-583),Затем еще дважды седиментируют,соответственно, флотируют фракциюпри плотностях 1,080 и 1,210. ЛНПфракция очищается с помощью аффинной хроматографии через иммобилизованный коякавалин А(РеЬя. Ьегг 1974,91, 174-198) или посредством СеопРечг соп-В 1 лоск-электрофореза электрофоретически согласно КЛ. ИаЫеуК.Я. Но 1 сошЬе (1977), Л,Ь 1 р 1 й. Кев18, 314-324.Б. Получение антисыворотки. Видживотных: овцы или кролики.При применении полученного по п,Аиммуногена используют схему иммунизации, приведенную в табл, 1,1 мг протеина (ЛВП), эмульгированного в Ргецпй Ай 1 ичапвИХН-способ Иммунологическое осаждение 238 503 214 Мутный 591 638 510 Прозрачный 237 231 350 ПрозрачныйМутный 102 195 Содержитхиломикроны 149 130 231 379 Содержание холестерина в пробе Проба До осаждения После осаждения 61,4 2,6 Хиломикр оны 23,2 2,8 ЛОНП 165,0 177,0 ЛНП 00 50,9 ЛВП ВНИИПИ Заказ 631/64 Тираж 777 Подписное Произв,-полигр, пр-тие, г. Ужгород, ул, Проектная, 4 В качестве стандартного метода служит Я 1 Н - способ (после отделения ЛОНП и хиломикронов в ультрацентрифуге осаждается ЛНП). Из разницы между величиной холестерина до и после осаждения получают значения для ЛНП- холестерина.Мапца 1 оЕ 1 аЪогагогу ОрегаСопз, ЬхрЫ НезеагсЬ С 11 п 1 сз Рго 8 гаш, 1,1 рЫ 30 апй 1 гроргогегп Апа 1 узхз, ПНИ РцЪ 11- саг.акоп Н 65-628. Формула изобретенияСпособ определения липопротеинов 50 низкой плотности(ЛНП) в сыворотке крови путем осаждения примесей осаждающим агентом с последующим определением содержания ЛНП в надосадочной жидкости, о т л и ч а ю щ и й с я 55 тем, что, с целью ускорения способа,П р и м е р 2. Раствор по 50 мклсЛОНП, ЛВП, ЛНП соответственно хило- микронов смешивают со 150 мкл анти- сыворотки кроликов, которая получена, с помощью ЛВП в качестве иммуногена. После центрифугирования в надосадочной жидкости определяют содержание холестерина как описано в при - мере 1. В табл. 3 приведены результаты. Т а блица 3 в качестве осаждающего агента используют очищенную фракцию антител к ли-, опротеидам высокой плотности (ЛВП) нли антисыворотку к ЛВП, фрагменты антител ЛВП или обезжиренную ЛВП-антисыворотку, взятые в концентрации