Способ получения эндонуклеазы рестрикции, узнающей и расщепляющей последовательность нуклеотидов 5 tgatca-3

(5)5 С 12 й 9/14, 1 ЫЙ КОМИТЕТЯМ И ОТКРЫТИ ГОСУДАРСТВЕ ПО ИЗОБРЕТЕ ПРИ ГКНТ ССС БРЕТЕНИЯ ЛЬСТВ Оч 1 У СВИ К АВТ(71) Научно-исследовательский конструкторско-технологический институт биологически активных веществ(56) В 1 оаЬз, - Сага 1 оц, 1986-1987.Оецег М., Раг 1 Иоп Мйо 1 ез 61 егоцяе Т., Оцргег О., 1 е 1 гзсЬ 1.М. Тво гезгг 1 сг 1 оп епоопцс 1 еазез 1 гогп Вас 111 цз зрЬаег 1 сцз Взр Х 1 апб Взр ХИ. - йцс 1. АСЫз Вез 1987, ч, 15, й.9, р. 3919.Вприап) А,Н,ААг 1(пзоп ТЯс 1 а 1(у О., ВоЬеггз 8.1, А зресйс епбопцс 1 еазе Ров Вас 111 цз са 1 бо 1 угсцз. - йцс 1. Асс 1 з Вез 1978, ч. 5, й,10, р, 3457-3467.(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЭНДОНУКЛЕА-.ЗЫ РЕСТРИКЦИИ, УЗНАЮЩЕЙ И РАСЕПЛЯ 1 ОЩЕЙ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСКЛЕОТИДОВ 5-Т 6 АТСАИзобретение относится к биотехнологии и генной инженерии и касается получения сайт-специфической эндонуклеазы, способной узнавать и расщеплять последовательность нуклеотидов 5"-Т 6 АТСА.Рестриктаза такой специфичности может быть использована для исследования первичной структуры ДНК, физического картирования различных геномов, расширя-. ет возможность конструирования гибридных молекул по сайту, имеющему в своей основе широко распространенный тетрануклеотид 5 -САТС. я ОПИСАНИ(57) Изобретение относится к биотехнологии и генной инженерии. Целью изобретения является увеличение выхода и повышение активности целевого продукта, Способ предусматривает использование в качестве штамма - продуцента Вас 111 цз згеагойегворЫ цз (В КПМ В), имеющего легко разрушаемые ультразвуком бактериальные стенки и содержащего только одну рестриктазу, что позволяет увеличить выход целевого фермента в 1,5 раза, облегчить выделение и очистку фермента. Выход фермента 65000 ед,/г биомассы, активность 15 ед./мкл, Рестриктаза Взг 77, полученная по предлагаемому, способу, является изошизомером Вс 11 и может полностью заменить ее во всех генно-инженерных работах. Известен способ получения рестрикта Взг 61 (сайт узнавания 5-Т 6 АТСА) и В 6 И (сайт узнавания 5-ССА/Т 66-3) из шта ма Вас 11 цз згеагог 1)еггпорЫ 1 цз 63. Недостатком данного способа являетс наличие двух активностей, что затрудняе получение чистого фермента, узнающего расщепляющего последовательность нукл отидов 5 -Т 6 АТСА. Известен способ получения рестрикт зы Взр ХП (сайт узнавания 5 -Т 6 АТСА) Взр Х 1 (сайт узнавания 5-АТС 6 АТ), вклю чающий в себя культивирование штаммВасцз зрЬаегСцз, хроматографические стадии очистки.Недостатком данного способа является невысокий выход фермента Взр Х 1, который составляет приблизительно 40000 ед,/г сырой биомассы. Кроме того, наличие двух ферментов усложняет процедуру очистки и получения целевой рестриктазы без интерферирующего загрязнения.Наиболее близким к предлагаемому является способ получения рестриктазы Всузнающей и расщепляющей сайт 5- ТОАТСА, включающий в себя использован ие штамма - и родуцента Вас 11 ц з са 1 бо 1 убсцз, культивирование его для получения биомассы, многократную дезинтеграцию биомассы, выделение и очистку рестриктазы хроматографическим способом.Недостатками известного способа являются низкий выход целевого фермента (40000 ед,/г сырой. биомассы) и низкая активность фермента (1 ед,/мкл), а также прочность клеточной стенки штамма затрудняет разрушение биомассы и требует многократной дезинтеграции.1 елью изобретения является увеличение выхода и активности целевого продукта.Поставленная цель достигается тем, что согласно способу получения рестриктазы в качестве продуцента используют штамм Вас 1 цз зеагойегаорЫ 1 цз (ВКПМ 8-5209),Штамм выделен из термальных источников в результате поиска продуцентов биологически активных веществ.Полученный штамм Вас 1 оз зтеагойеггпорЫ 1 цз депонирован в ВКПМ ВНИИгенетики под регистрационным номером В, а продуцируемая им рестриктаза названа Взт 71 1 согласно общепринятой номенклатуре.Штамм Вас 11 цз зееагсйЬегворЫцз характеризуется следующими признаками,Морфологические признаки.Клетки палочковидные, прямые или слегка изогнутые (0,5-0,75) х (2-14) мкм, подвижные, Образуют эндоспоры овальнойформы, терминального расположения, вздутые относительно размеров вегетативной клетки. Окраска по Граму вариабельная.Культуральные признаки.Штамм нетребователен к факторам роста, хорошо растет на обычных питательных средах(СПА, МПА, МПБ). На агаризованных средах образует мелкие круглые, непигментированные колонии, прозрачные, блестящие, с ровным краем. Оптимальная температура роста 65 С, рН 7,0-1,2. 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Культуру поддерживают пересевом на плотных средах, хранят в растворе глицерина при -70 С или в лиофильно-высушенном состоянии,Физиологические признаки,Не восстанавливает нитраты, отрицателен по лецитиназе, в реакции с метиловым красным и Фогес-Проскауера; не гидролизует крахмал, казеин, желатин, эскулин; не использует малонат, цитрат, не растет при концентрации МаС 1 5 ои 0,001 лизоцима; энергично образует кислоту иэ глюкозы, очень слабо - из арабинозы, ксилозы и маннита; не дезаминирует фенилаланин, не выделяет индол и сероводород.Штамм высокочувствителен к антибиотикам: пенициллину, карбенициллину, ампициллину, гентамицину, метициллину, сульфатиазолу, линкомицину; менее чувствителен к тетрациклину, мономицину, неомицину, олеандомицину, левомицетину, канамицину, ристомицину, рифампицину; слабо чувствителен к полимиксину; устойчив к стрептомицину,Для культивирования Вас 111 оз зсеагойеггпорЫцз Вприменяют среду следующего состава, г/л: пептон 10; дрожжевой экстракт ("ООсо") 5; глюкоза 5; дистиллированная вода остальное. Культивирование проводят при 65 ОС и интенсивной аэрации до достижения стационарной фазы роста.Выход целевого фермента 65000 ед./г сырой биомассы с активностью 15 ед./мкл,Отличием предлагаемого способа от известного является использование нового более продуктивного штамма Вас 11 цз зтеагойегаорЫоз, превышающего по выходу известный более, чем в 1,5 раза, с более высокой активностью выделяемого целевого фермента, способностью легко лизироваться. при ультразвуковой дезинтеграции,П р и м е р, Штамм выращивают в питательной среде следующего состава, г/л: пептон 10; дрожжевой экстракт 5 ("ОИсо"); глюкоза 5; дистиллированная вода остальное. Культивирование проводят при 65 С с аэрацией 2 об./мин, а при перемешивании 150 об/мин до стационарной фазы роста. Клетки собирают центрифугированием при 5000 9 и температуре 4 С,Биомассу весом 5 г загружают в стеклянный химический стакан, добавляют 10 мл 10 мМ калийфосфатного буфера (рН 7,0), содержащего 1 мМ ЭДТА, 7 мМ 2-меркаптоэтанол (буфер А) с добавлением 0;4 М хлористого натрия, перемешивают при помощи магнитной мешалки до получения гомогенЗаказ 1150 Тираж Подписное ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР 113035, Москва, Ж. Раушская наб., 4/5 Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул.Гагарина, 101 ной суспензии. добавляют 6 мг лиэоцима иперемешивают в течение 30 мин.Суспензию разрушают на ультразвуковом дезинтеграторе на резонансной частоте 22 кГц. 5Озвученную суспензию переносят встакан, содержащий 50 мл ПЭГ(11,2)и декстран Г(3,5%), помещают на магнитную мешалку и при постоянном перемешивании добавляют 4 М раствор йаС до .10конечной концентрации 0,5 М. Смесь перемешивают в течение 5 мин,Для разделения фаз суспенэию центрифугируют на центрифуге 6-21 при 20000об/мин в течение 10 мин, Полученный грубый экстракт (25 мл) разбавляют в два разабуфером А и наносят на колонку с гидроксилапатитом объемом 25 мл. Примесные белкиудаляют промыванием буфером А, содержащим 0,2 М МаС 1. Элюцию фермента проводят линейным градиентом йаС 0,01 - 0,25 Мконцентрации буфером А. Фракции, содержащие целевой продукт, собирают, фер-.мент разбавляют в 1,5 раза 20 мМ трис-НО(рН 7,5), содержащим 0,1 мМ ЭДТА, 7 мМ 252-меркаптоэтанол, 10%-ный глицерин (буфер В).и наносят на колонку с гепарин-сефарозой 4 В объемом 30 мл. Примесные белки.удаляют промыванием буфером В, содержащим 0,2 М йаС, Фермент элюируют линейным градиентом 0,2-1,0 М йаС в буфере В.Фракции, содержащие целевой продукт,объединяют и диализируют против 50 мМтрис-НС 1 (рН 7,9), содержащего 1 мМ ЭДТА,7 мМ 2-меркаптоэтанол. 0,020 -ный тритон 35Х, 60%-ный глицерин. Выход фермента 65000 ед.акт./г сыройбиомассы, активность 15 ед,/мкл, Препаратне содержит примесей эндонуклеаз. За единицу активности принимают минимальноеколичество фермента, необходимое дляполного расщепления 1 мкг ДНК фага А втечение 1 ч при 37 С.Предлагаемый способ по.сравнению сизвестным обеспечивает повышенный выход целевого фермента (более, чем в 1,5раза), облегчает выделение и очистку фермента от интерферирующей рестриктаэнойактивности, поскольку используемыйштамм продуцирует только одну рестриктазу, позволяет повысить активность рестриктазы более, чем в 10 раэ, а также облегчаетразрушение клеточных стенок бактерий приультразвуковой дезинтеграции.Поскольку рестриктаза Вм 77имеетсайт узнавания 5-ТОАТСА, идентичныйсайту узнавания рестриктаэы Вс 1, она может заменить последнюю во всех генно-инженерных работах,Формула изобретенияСпособ получения. эндонуклеазы рестрикции, узнающей и расщепляющей последовательность нуклеотидов 5 -ТОАТСА,включающий культивирование продуцирующего микроорганизма рода Васвз, дезинтеграцию биомассы, выделение ихроматографическую очистку фермента, о тл и ч а ю щ и й с я тем, что, с целью увеличения выхода и активности целевого продукта, в качестве продуцента используютштамм Вас Ицз зтеагойеггпорЫцз ВКПМ В 5209.