Способ культивирования изолированных пыльников злаковых растений

СОЮЗ СОВЕТСКИХСОЦИАЛИСТИЧЕСКИХРЕСПУБЛИК 17 688 А 9) .д 2 О. 12 й 5/04, А 01 Н 4/00 МИТЕТТКРЫТИЯ ГОСУДАРСТВЕННЫЙПО ИЗОБРЕТЕНИЯМПРИ ГКНТ СССР ИО МИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ У ТВИД.ТЕЛСТ АВТО(71) Институт биологии Башкирского научного центра Уральского отделения АН СССР(56) Лукьянюк С,ф., Игнатова С,А. Факторы,определяющие морфогенез и выход гаплои-.дов в культуре пыльников тритикале И. Теор.и прикл. аспекты селекции и семеноводствапшеницы, ржи, ячменя и тритикале, Тез.докл. Межд. конф, уч. стран СЭВ-Одесса:ВСГИ, 1981, с. 34 - 35,Не Опд-дапд, Оцуапд )цп/еп, СаПцзапб рамет 5 оппаоп агою сцтцгеб вйеатапйегз ат бЛегепт бечеортега зтадез. -Рапт Зсепсе .еиегз., 1984, 33, р. 71-79.Романов И.Д. Развитие пыльцы пшеницы по наблюдениям на живом материале. -И бюл., ВИР, 1970, вып. 5, с, 38-46.Оа Р,: Роеп беогрЫзв апб аптпегсц 1 цге Ьагеу, - Раптз, 1975, ч, 127, М 3, р.213-220.Батыгина Г.Б. Хлебное зерно, Атлас, -Л.: Наука, 1987, с, 103.Паушева З,П. Практикум по цитологиирастений, - М.: Агропромиздат, 1982, с. 272.Оцуапд Т,чч., Н. Н ц, С.С. СЬцапд апб С,С,Тзепд //пбцстгоп о 1 роИеп раптз йовапйегз от ТГЮсцв аезтчцгп , сц 1 цгеб ич 1 го. - //Зс. Яи, 1973, 16, р. 79 - 95.(54) СПОСОБ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ ИЗОЛИРОВАННЫХ ПЫЛЬНИКОВ ЗЛАКОВЫХРАСТЕНИЙ Изобретение относится к биологии и жет быть использовано в змбриологии и уточнении стадий микроспорогенеза, в(57) Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано при культивировании пыльников гибридных. растений для получения нового исходного материала, Целью изобретения является увеличение выхода змбриоидных структур. Способ предусматривает .выращивание пыльников на искусственной питательной среде с получением растений-регенерантов, при этом перед помещением пыльника на среду цитологически выявляют наличие фиброзных утолщений эндотеция стенки пыльника среднего колоска колоса, что соответствует наиболее благоприятной для андрогенеза стадии развития микроспор. 5 табл,генетике и биотехнологии при культивировании пыльников гибридных растений с целью получения гибридных линий продви5 10 20 30 40 45 50 нутых поколений и селекции - для созданиямногообоазного исходного материала иконстантных гибридных линий.Известен способ культивированияпыльников злаков, при котором которомпыльники имплантируются на искусственную питательную среду на стадии, когдамикроспорв проходит 2 фазу клеточногоцикла.Недостатком этого способа являетсяневозможность точного определения названной стадии развития микроспор.Известны работы, в которых указывается, что оптимальной стадией является стадия средней или позднейвакуолизированной микроспоры. 1Однако и в этой, работе не указывается,как ее определить, поскольку показано, чтоналичие вакуоли является не самым главным признаком при определении стадииразвития микроспоры. Основным критерием при определении стадий одноядерногопыльцевого зерна является расположениеядра по отношению к поое. Наличие большой вакуоли, оттесняющей ядро к стенке,противоположной поре прорастания, позволдет отнести такую микроспору к поздней одноядерной стадии,Вакуоль появляется уже в средней одноядерной стадии развития микроспоры.Ядро при этом занимает различное положение по отношению к поре,В то же время известно, что в один и тотже момент наблюдения в одном и том жепыльнике будут наличествовать микроспоры на разных стадиях развития, 3Недостатком известных способов является расплывчатость и неконкретность в определении стадии имплантации микроспор,На основании цитологического изучения большого количества микроспор в пыльниках некоторых видов злаковых, таких, какяровая мягкая пшеница, озимая рожь и тритикале, в течение ряда лет дает основаниеуточнить имеющуюся классификацию стадий микроспорогенеза и дополнить ее новыми характеристиками, касающимися каксостояния микроспор, так и стенок пыльника. Подвергается существенной коррекциипоздняя одноядерная стадия развития микроспоры пыльника, на которой ядро микроспоры оттесняется центральной вакуольюна противоположную поре микроспоры сторону,Она продолжительна.во времени и заэто время происходят существенные изменения в стенке пыльника, Синхронизация 5стадий микроспорогенеза и состояния стенок пыльника проведена впервые.Иэ анатомии растений известно, чтостенка пыльника состоит иэ экзотеция, эндотеция и тапетума. На поздних стадиях развития пыльника в эндотеции появляются фиброэные утолщения.Однако в этих ссылках нет указаний на состояние микроспор или пыльцевых зерен, соответствующих данной стадии,Мелкие фиброзные бляшки впервые появляются, когда популяция микроспор в пыльнике имеет следующий состав: 50; микроспор на средней стадии микроспорогенеза; 50 микроспор на поздней стадии,Синхронно с увеличением популяции поздних микроспор утолщается и фиброэный слой эндотеция, Изолирование пыльников на этой стадии и культивирование их напитательной средеи чтго позволяет получать наивысший выход эмбриоидных структур.Целью изобретения является увеличение выхода эмбриоидных структур.Способ состоит в том, что проводят определение стадии развития микроспор, культивирование их на питательных средах, получение эмбриоидов и регенерацию из них растений, при этом основной упор делается на точное определение стадии развития микроспор, способныхк прямому эмбриоидогенеэу.Способ осуществляют следующим образом.У пыльников средней части колоса определяют стадию развития микроспор. Для этого готовят сдавленный ацетокарминовый препарат, Проводят подсчет числа микроспор с различной стадией развития, Для определения стадии развития микроспоризвлекают пыльник из колоска средней части колоса. Располагают его в каплю 1(-ногоацетокармина на предметном стекле. Каплю разогревают на пламени спиртовки, недопуская закипания, Затем препарат кантируют покровным стеклом и раздавливают. Исследуют препарат в микроскопе в проходящем свете. Отмечают стадии развития микроспор, подсчитывают количество микроспор.На этом же препарате исследуют стенки пыльника. Фиброзные утолщения имеются, если большинство микроспор (70-90) находятся на поздней одноядерной стадии - единственное ядро микроспоры оттеснено вакуолью к стенке микроспоры, отстоящей напротив поры. Отбирают колосья, содержащие такие микроспоры (т.е. хорошо развитые фиброзные утолщения в стенкепыльника), стерилизуютдиацидом, изолируют пыльники, культивируют их на питательной среде Ро 1 ато 11 (табл. 5), в которой представлен состав питательной среды для1724688 Та блица фиброзные утолщения Количество.Год культи ви рования Сортвг Поздних микро- спор,Образовавщихсяэмбриоидов, 3 Культи- вированных пыльников,шт 7 Й 282 7128 1151258 317 6221 . 218 2,561 412 . 3118 115 1 5 Скала 1987 ЕстьНетЕстьНетЕстьНет 1988 1989 инициации эмбриоидов в культуре изолированных пыльников яровой пшеницы.Поверхностно стерилизованные пыльники, извлеченные из двух нижних цветков 6-8 колосков средней части одного колоса, 5 помещают в одну биологическую пробирку с питательной средой, Штативы с пробирками ставят в темноту на 7 дней в термостаты с температурой+32 С. Затем культивирование продолжают в темноте при 27 С до об разования эмбриоидов.П р и м е р 1. Колосья сорта яровой мягкой пшеницы Скала срезают в поле или в теплице. Цитологически выявляют наличие фиброэных утолщений в эндотеции с 15 одновременным подсчетом числа поздних микроспор. При нахождении соответствующей стадии колосья стерилизуют, изолируют пыльники и имплантируют их на питательную среду, Через 28-30 дней куль тивирования появляются первые эмбриоды (табл. 1).П р и м е р 2. Аналогично примеру 1 производят культивирование изолированных пыльников сорта Соналика (табл, 2), 25П р и м е р 3, Аналогично примеру 1 определяют стадию развития микроспор и фиброзных утолщений у Линии 35, Данные приведены в табл, 3.П р и м е р 4. Аналогично примеру 1 исследуют культуры изолированных пыльников озимой ржи сорта Чулпан и тритикале (табл, 4).Преимуществами изобретения являются высокий выход эмбриоидов, быстрота определения стадии развития, большая экономия времени, средств и реактивов, возможность круглогодичного эксперимента, многократное увеличение выхода эмбриоидов и растений в культуре 1 и ч 1 ио по сравнению с известным способом. Формула изобретения Способ культивирования изолированных пыльников злаковых растений путем помещения пыльников на искусственную питательную среду и выращивания до образования эмбриоидов, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что, с целью увеличения выхода эмбриоидных структур, перед помещением пыльников на питательную среду цитологически выявляют наличие фиброзных утолщений эндотеция стенки пыльника среднего колоска колоса.1988 1989 Т а б л и ц а 3 Год культивирования фиброзныеутолщения Количество Сорт образовавшихся эмбриоидов, 3 позднихмикроспор,культивированныхпыл ьни ко воЕстьНетЕстьНет Линия 35 1988 64 17 72 22 318 119 318 214 711,758 1989 Таблица 4 Сорт фиброз ные утолщения Год культи"вирования Количество культивированных пыльников,щт. позднихмикро"спор, Ф 1988 314 117 412 115 ЕстьНетЕстьНет 1988 Сона" 1986лика1987 Чулпан1724688 10 Табли ца 5 Состав питательной среды Роайо 11 Компоненты Содержание компонентовв среде РойаСо 11, мг/л Картофельныйэкстракт 10 1000 кю,Са(ИО) 4 Н ОМКБ 04 7 Нго.Пиридоксин"НС 1ийЬтиновая кислота Аспарагиновая кислотаСахароза2,4"Д 70000 0,1-1,5 Индолилуксусная кислота КинетинИезо-инозит 5,8 рН Составитель В. ГорбуноваТехредМ. Моргентал Корректор М. Кучвряввя Редактор И. Дербак Производственно-издательский комбинат "Патент", г, Ужгород, ул.Гагарина, 101 Заказ 1150 Тираж Подписное ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР 113035, Москва, Ж, Раушская наб., 4/5