Штамм бактерий тнеrмus ruвеr-продуцент рестриктазы tru 9 1

(51)5 С 1 у М 9/14, 1/20 ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМПРИ ГКНТ СССР ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ 2 К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ(71) Научно-исследовательский и консте рукто рско-технологический институтбиологически активных веществ Научно-производственного объединения "Вектор" иИнститут микробиологии АН СССР(56) Зато З., НцсЫэоп С., Нагг 1 в .1 А йегаоэтаЫе эерцепсе - эрес 11 с епсопцсеазе 1 гогпйегецз ас 1 цатсцз. - Ргос, Нот Асад. Зс. ОЗА,1977, ч, 74, к 1. 2 р. 542 - 546.Могцап В.О. Мзе 1, а цп 1 цце геворгсбопепбопцсеазе 1 гогп М 1 сгососсцэ эресезччЫсЬ гесо 9 пзев 5 ТТАА 3 . - Йцс 1, Асада.Вез 1988, ч. 16, М 7, р, 3104. Изобретение относится к биотехнологии и генной инженерии, в частности к получению эндонуклеазы рестрикции, способной узнавать и расщеплять нуклеотидную последовательность 5 ТТАА 3. Цель изобретения - выявление штаммаТЬегщцз гцЬег - продуцента рестриктазы,являющейся изошизомером Мэе, обладающего более высоким выходом,Штамм ТЬеппцэ гцЬег 9 выделен из горячих источников и депонирован во Всесоюзной коллекции микроорганизмов ИБФМАН СССР под номером ВО,Штамм обладает следующими свойствами,Ю 1687614 А 1(54) ШТАММ БАКТЕРИЙ ТНЕЯМОЗ ВОВЕВ -ПРОДУЦЕНТ РЕСТРИКТАЗЫ Тгц 91(57) Изобретение относится к биотехнологии и генной инженерии. Цель изобретения - выявление штамма ТЬегвцз гцЬег - продуцента рестриктазы, являющейся изошизомером Мзе 1, обладающего более высоким выходом, Штамм ТЬегвцэ гцЬег ВКМ ВД (9) получен в результате поиска продуцентов-рестриктаз среди термофильных бактерий горячих источников, хорошо растет на синтетической среде с сахарозой, мальтозой, рамнозой, галактозой, на натриевых солях уксусной, пировиноградной, яблочной, янтарной кислот, не восстанавливают нитраты до нитритов. Выход фермента 6000 ед/г биомассы, что в 3 раза больше известного, активность 12000 ед/мл. Мор фоло го-кул ьтурал ьн ые приз на ки. Палочки диаметром 0,5 - 0,75 мкм, длиной 4 3 - 6 мкм или нитевидные клетки длиной 15 - 0 40 мкм. Бактерии грамотрицательные, не- а подвижные, жгутики и споры отсутствуют, ф,Колонии на картофельно-пептонном отаре ярко-оранжевого цвета, круглые, бле )в стящие, гладкие с ровным краем. В жидкой картофельной среде в пробирках рост в вигыагыыг де мути у поверхности среды.Физиологические признаки. Строгий аэроб, оптимум роста 60 С, рН оптимум 7,8- 8,2. Хороший рост наблюдают на картофельной среде (20) с 0,50 ь пептона и 0,02 дрожжевого экстракта, Время генерации 60 мин.Бактерии хорошо растут на синтетической среде с сахарозой, мальтозой, рамнозой, галактозой, хуже растут на среде с маннитом и глицерином, Хороший рост отмечен на натриевых солях уксусной, пировиноградной, яблочной, янтарной и фумаровой кислот. Слабый рост на-фруктозе, ксилозе,-арабинозе, раффинозе, Нет роста на среде с инулиномсорбозой, декстрином и лимоннокислым натрием. На среце с 0,25% глюкозы обнаружен рост, при концентрации глюкозы 0,5% рост бактерий ингибировался.Нет роста на среде с аланином, глицином, аспарагином, нитратом, сульфатом аммония и мочевиной. Растет на среде с гистидином, аспарагиновой кислотой, хуже с метионином и орнитином, На синтетической среде с лактоэой хорошим источником азота является пептон.Бактерии не восстанавл 1 вают нитраты до нитритов, крахмал и казеин не гидролизуют, молоко, разбавленное в 5 раэ, свертывают и пептонизируют, гидролизуют желатин в концентрации 10 и 50%, сероводород, индол и ацетоин не образуют, серу и тиосульфат не окисляют, Бактерии чувствительны к ИаС в среде (1% йаС в среде ингибирует рост бактерий), образуют каталаэу, антибиотики не образуют. Культура способна растворять клеточные стенки грамположительных и грамотрицательных бактерий. Минимальная температура роста на агариэованной картофельной среде 40 С, оптимальная 60 С, максимальная 70 С.Культуру хранят в лиофильно высушенном состоянии,Для культивирования Т,гцЬег 9 применяют питательную среду следующего состава, %:Картофельный отвар 20Пептон 0,5Дрожжевой экстракт 0,02рН 7,8 - 8,2, Культивирование проводят при 60 С в течение 14 ч.Выход биомассы 1 г/л культуральной жидкости.Выход рестриктазь Тгц 91 6000 ед/г биомассы.П р и м е р. Культивирование штамма, получение биомассы,Клетки ТЬепп цв гц Ьег высевают на твердую среду, содержащую 20%-ный картофельный отвар, 0,5%-ный пептон и 0,020/,-ный дрожжевой экстракт, инкубируют в течение 1 сут при 60"С, затем вносят петлей в 100 мл жидкой сред.ого же состао ва и подращивают в течение .ч при 60 С, Полученный инокулчт носчт в 2 л среды и5055 Определение последовательности нуклеотидов, узнаваемой рестриктазой Тгц 91.Для определения последовательности нуклеотидов, узнаваемой рестриктазой Тгц 91, проводят сравнение экспериментально полученных длин фрагментов при гидролиэе ДНК фага Л и рВВ 322 с расчетными длинами фрагментов для различных нуклеотидных последовательностей, Проведенный анализ показал, что существует единственная последовательность, для которой расчетные длины фрагментов совпавыращивают и ри 60 С. в течение 14 ч. После охлаждения клетки собирают центрифугированием, Выход биомассы 1 г сырой массыс 1 л среды.5 Получение рестриктазы Тгц 91.2 г клеток суспендируют в 20 мл 0,02 Мбуфера трис-НС 1, рН 7,5, содержащего10М 3-меркаптоэтанола и 0,1% тритонаХ, и разрушают на ультразвуковом дез 10 интеграторе. Обломки клеток удаляют цент.рифугированием, надосадочную жидкостьнаносят на 20 мл фосфоцеллюлозы Р - 11(0,02 М К-фосфат, 4 оН 7,5, 0,001 М З-мер-.15 каптоэтанол, 5 10 М ЭДТА), Затем колонку промывают буфером А до исчезновенияУФ-поглощающего материала в элюате, Адсорбированный материал элюируют 240 млградиентом 0-1,0 М йаС в буфере А. Объем20 каждой фракции 8 мл. Аликвоты из каждойфракции (мкл) инкубируют 1 ч при 60 С с 1мкг ДНК фага Ли анализируют в геле агарозы. Фракции, расщепляющие ДНК фага Л(24 - 28), объединяют, диализуют 4 ч против25 2 л буфера А и наносят на колонку с 10 млбенэил-ДЕАЕ-целлюлозы (Яецва).Фермент элюируют 120 мл градиентом0-1,0 М МаС в буфере А, Объем фракций 4мл. Фракции 6 - 8, содержащие рестриктаз 30 ную активность, объединяют, диалиэуют 2 чпротив 2 л буфера А и наносят на колонку с5 мл гепарин-сефарозы (РЬаггпаса). Элюцию ведут линейным градиентом МаС 0 - 1,0М в буфере А объемом 60 мл, Объем фракций35 2 мл. Фракции 13 - 14, содержащие Тгц 91,объединяют и диализуют против буфера А с50%-ным глицерином. Полученный препарат фермента (1 мл) имеет активность 12000ед/мл.40 За единицу активности принимают минимальное количество фермента, необходимое для полного расщепления 1 мкг ДНКфага Л в течение 1 ч при 60 С,Ферментный препарат хранят при - 20 С.Выход фермента 6000 ед/г биомассы,1687614 работах. Выход Тго 91 в 3 раза превышает выход известного соответствующего фермента,Формула изобретения 5 Штамм бактерий Тйеггпцз гоЬег ВКМ. ВО продуцент рестриктазы Тги 91..3 дают с экспериментально полученными для Тго 91, а именно последовательность ТТАА. Таким образом, фермент Тго 91 является изошизомером Мзе и может быть использован вместо него во всех генно-инженерных Составитель И. ПриваловаТехред М,Моргентал Корректор Т. Палий ф Редактор М, Петрова Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул,Гагарина, 101 Заказ 3678 Тираж Подписное ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР 113035, Москва, Ж, Раушская наб., 4/5