Штамм ротавируса человека для получения иммунобиологических препаратов

СОЮЗ СОВЕТСКИХСОЦИАЛИСТИЧЕСКИХРЕСПУБЛИК 9) ЯЦ 51)5 С 12 КИ 9 Ю 3 В ТЕН ГОСУДАР СТВ Е ННЫ Й КОМИТЕТПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯПРИ ГКНТ СССР ПИСАНИЕ ИЗОБ ВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ(56) Букринская А,Г. идр. Морфологическая характеристика ротавирусов и структура их генома. - Вопр. вир., 1986, В 2, 190 - 197,Васильева В.И. и др. Выделение ротави- руса человека на культуре клеток почек зеленых мартышек. - Вопр. вир 1986, В 3, с.360 в 3. Изобретение относится к медицинской вирусологии, в частности к разработке диагностических и лечебно-профилактических препаратов.Цель изобретения - получение высоко- репродуктивного штамма ротавируса человека (РВЧ).Штамм депонирован в Государственном центре патогенных микроорганизмов МЗ СССР (Вирусы), номер депонента ГКВ М 2172.Характеристика штамма,Название вируса штамма: ротавирус человека, штамм ".Минск".Место в универсальной системе: семейство ротавирусов, род ротавирусов, ротавирусы человека,1687613 А 1(54) ШТАММ РОТАВИРУСА ЧЕЛОВЕКА ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ ИММУНОБИОЛОГИЧЕСКИХ ПРЕПАРАТОВ(57) Изобретение относится к медицинской вирусологии, в частности к разработке диагностических и лечебно-профилактических препаратов, Цель изобретения - получение высокорепродуктивного штамма ротавируса человека. Ротавирус человека "Минск" характеризуется следующими свойствами: размер 65 - 70 нм, геном - двухцепочечная сегментированная (11 фрагментов) РНК. Вирус не обладает гемагглютинирующей активностью. Штамм "Минск" характеризуется высокой репродуктивной способностью - титр 10 - 109 10 ГЦД 5 о/мл, Штамм депонирован в Государ- Б ственном центре патогенных микроорга.- низмов МЗ СССР (Вирусы), номер депонента ГКВ В 2172, 2 табл. Штамм выделен из фекалий ребенка с диагнозом острой кишечной инфекции.Физико-химические свойства: криптограмма, размер 65 - 70 нм, РНК двухцепочечная,Генетические признаки: геном, сегментированный из 11 сегментов, так называемый "длинный" электрофоретип.Прочие свойства: адаптирован в культуре клеток МА, вызывает ЦПЭ через 2 сут после инфицирования, не агглютинирует эритроциты морской свинки и человека.Антигенные свойства. В тестах иммуноферментного анализа, встречного иммуноэлектроосмофо реза, иммуноэлектрон ной микроскопии отмечается специфическое взаимодействие с иммунными поликлональ 168 7613ными сыворотками к штаммам В/а, 5 А 11 ротавирусов; в иммуноберментном анализе в 4 и более раз активнее с гомологичной антисывороткой, чем штамм О/а с антисывороткой к штамму "Минск".Эпидемический штамм ротавируса человека "Минск" адаптирован к перевиваемой культуре клеток МА, По своим свойствам ш гамм отличается от других штаммов: ротавируса человека Юа и обезьян ЯА, Штамм "Минск" характеризуется высокой репродукционной способностью (10 - 10 ) и может быть использован при разработке и производстве диагностических и лечебно-профилактических препаратов,Ниже приведены примеры, иллюстрирующие способ получения штамма "Минск" и анализ его свойств,П р и м е р 1. Выделение вируса, адаптация к культуре клеток МА,Выделение вируса, Обработанную фреоном10 -ную суспензию фекалий, приготовленную на растворе Хенкса, центрифугируют при 3000 об/мин в течение 30 мин +4 С. С целью дополнительной очистки суспенэии ее центрифугируют при 6000 об/мин 30 мин. Надосадочную жидкость переносят в стерильные флаконы и хранят при - 200 С. Наличие вируса в суспензии подтверждают методами ЭМ, ВИЭОВ (электронная микроскопия, встроечный иммуноосмоэлектрофорез).Адаптация к культуре клеток МА, Пенициллиновые флаконы с перевиваемой 4-дневной культурой клеток МАпромывают солевым раствором Хенкса для удаления остатков сыворотки ростовой среды. На выросший слой клеток вносят по 0,2 мл 100 - ной суспензии фекалий, обработанной смесью антибиотиков (100 ед/мл пенициллина, 100 мг/мл стрептомицина), а также трипсин (5 мкг/мл) и инкубируют в течение 30 мин, Флаконы центрифугируют в угловом роторе при 1000 об/мин 1 ч, Затем содержимое флаконов сливают и вносят по 1,0 мл поддерживающей среды (смесь равных объемов среды 199 и среды Игла с добавлением трипсина (2,5 мкг/мл). Флаконы помещают в роллерную установку и инкубируют при 37 С в течение 2-3 сут. О репродукции вируса судят по ЦПЭ (цитопатическому эффекту), Содержимое пенфлаконов 2-кратно замораживают-оттаивают (для разрушения клеток), полученные лизаты в дальнейшем используют для следующего пассажа в культуре клеток (по описанному методу), а также для определения титра вируса, По данным электронной микроскопии в полученных клеточных лизатах обнаруживают вирионы диаметром 65-.70 нм с характерной для ротавирусов структурой, Проведенные расчеты показывают, что концентрация вирионов в кульгуральной среде достигает 109/мл, 5 Болыцинство вирусных частиц имеет непроницаемую для контрастирующего вещества сердцевину, однако у части из них оно заполняет центр вириона, свидетельствуя о принадлежности к так называемым "пус тым" неинфекционным частицам.П р и м е р 2. Определение титра вируса,Для определения титра вируса в полученной таким образом вируссодержащей15 культуральной жидкости готовят ряд гесятикратных разведений от 10 до 10 (нарастворе Хе н кса), Тит рован ие и ро водят напенициллиновых флаконах с перевиваемой4-дневной культурой клеток МА. Культи 20 вирование проводят по схеме, изложеннойв примере 1, использованной для адаптациивируса, за исключением того, что для заражения вносят по 0,1 мл каждого разведениявируса, Титр вируса определяют на 4 сут по25 ЦПЭ,В табл,1 приведены результаты титрования инфекционной активности штамма"Минск" ротавируса человека,ТЦДв 0 в 1 мл =- 9,96+0,18,30 ТЦД,0 рассчитывают статистически поРиду и Менчу в модификации Кербера, Расчеты выполняют по программе "В/Г".П р и м е р 3, Определение гемагглютинирующей способности вируса "Минск",35Реакция гемагглютинации РГА. Ставятреакцию с 0,5 эритроцитами морской свинки и 0 (1) группы крови человека на 0,5 М фосфатном буфере (ФСБ) по общеприня той методике, В качестве положительногоконтроля применяют штамм ротавируса обезьян (ЯА), сконцентрированный в 100 раэ. В сравнительных опытах со штаммами "Минск" и ЯАротавируса обезьян ус тановлено, что в отличие от ЯАвыделенный штамм не вызывает агглютинации 0,5 -ной взвеси эритроцитов человека и морской свинки.П р и м е р 4, Изучение антигенных 50 свойств штамма РВЧ "Минск",а. Антигенные свойства штамма"Минск" исследуют с помощью иммунной электронной микроскопии, Для проведения иммунной электронной микроскопии 55 готовят следующие разведения ряда иммунных сывороток: 1/10, 1/50, 1/100, 1/1000.Полученные разведения сывороток смешивают с вирусной суспензией в соотношении 10:1 соответственно и оставляют на 1 ч при комнатнпй темпераг;ре. После этого проводят негативное контрастирование образовавшихся иммунных комплексов. В качестве контрольной используют нормальную сыворотку морской свинки.Иммунная микроскопия показывает, что иммунные сыворотки (как полученные на РВ БА, так и на штамм "Минск") в разведениях 1:50 - 1:1000 образовывают специфические иммунные комплексы (вероятно из-за наличия общих антигенных групп). Но иммунная сыворотка, взятая в качестве отрицательного контроля, специфического комплексообразования не дает со штаммом РВЧ "Минск".б, Антигенную активность штамма РВЧ "Минск" изучают также методом встречного иммуноэлектроосмофореза (ВИЭОФ). С помощью ВЙЭОФ исследуют штамм, а также сыворотки морской свинки, иммунизированной этим штаммом. В качестве пол.ожительного контроля применяют;1. Антиген - сконцентрированный в 100 раз рота вирус обезьян ЯА.2, Антитела - сыворотки морских свинок, иммунизированных культуральным РВ АГ из штамма ЯА.ВИЭОФ проводят на 1 -ном геле агарозы в веронал-мединаловом буферном растворе (рН 8,8, ионная сила 0,025),ВИЭОФ между штаммом "Минск" и гомологичной сывороткой, а также сывороткой, полученной на вирус ЯА, дает четкие линии преципитации, специфичность которых подтверждается отсутствием таких преципитатов при взаимодействии неиммунных сывороток с вирусом и иммунных - с культурой клеток, на которой репродуцируется вирус. Титр сывороток в этой реакции составляет 1:64 - 1:128.в, Создание тест-системы для твердофазного иммуноферментного анализа на основе штамма рота вируса человека "Минск",Основные компоненты системы: рота- вирусный антиген, специфическая антиротавирусная сыворотка, иммуноглобулин, используемый для сенсибилизации твердой фазы, антиротавирусный пероксидазный конъюгат.Ротавирусный антиген. Используют вируссодержащую взвесь на основе штамма "Минск", адаптированного к культуре клеток МА.Культуру клеток МАвыращивают роллерным способом в 0,5-литровых флаконах до образования полного монослоя. Вируссодержащую жидкость перед заражением обрабатывают трипсином в конечной концентрации 5 мкг/мл и инкубируют при комнатной температуре. Из флаконов сливают среду роста, а монослой трижды промываютраствором Хенкса,Вируссодержащую жидкость вносят вкаждый флакон в разведении 10 - 10по-2 -35 10 мл и инкубируют в термостате 1 ч при37 С в роллерной установке. Содержимоесливают и вносят по 50 мл поддерживающей среды (среда Игла и среда 199 в равном соотношении с добавлением 2,5 мкг/мл10 трипсина, 100 ед/мл пенициллина, 100 мкг/млстрептомицина, 0,031-глютамина). Зараженную культуру инкубируют при 37 С втечение 48 ч до появления максимальногоцитопатического эффекта (поражение 90 -15 100 клеток), Флаконы подвергают 3-кратному замораживанию-оттаиванию дляразрушения клеток. Обломки клеток удаляют низкоскоростным центрифугированиемпри 3000 и 6000 об/мин (по 30 мин), получен 20 ную надосадочную жидкость используютдля дальнейшей работы.Специфическую антиротавирусную сыворотку получают путем гипериммунизациикроликов ротавирусным антигеном (табл,2).25 Для иммунизации вируссодержащую суспензию концентрируют, добавляя 8; полиэтиленгликоля (М. 6000) и 0,15 М йаС 1.Инкубируют 18 ч при 4"С, после чего центрифугируют при 6000 об/мин 30 мин. Оса 30 док ресуспензируют в 1/1000 объемаисходного количества вируссодержащейсус пензии,В табл,2 приведена схема гипериммунизации,35 Выделение антиротавирусного иммуноглобулина проводят осаждением риванолом исульфатом аммония по общепринятым методикам,П р и м е р 5. Определение электрофо 40 ретической подвижности фрагментов генома штамма РВЧ "Минск".Выделение вирусной РНК. Для выделения нуклеиновых кислот (после удаленияклеточного дебриса центрифугированием45 при 8000 об/мин 10 мин) очищенную вирусную суспензию обрабатывают 1-ным додецилсульфатом натрия в течение 10 минпри интенсивном перемешивании, Последующими экстракциями водонасыщенным50 раствором фенола, хлороформом и эфиромпроводят депротеинизацию, Полученныйпрепарат РНК хранят при 4 С. Электрофорез Р Н К в пол иа криламид ном геле. Фрагменты РН К ротавирусов разделяют с помощью злектрофореза в 7,5 - 10;4-ном разделяющем полиакриламидном геле в прерывистой системе по Лемли при силе тока 10 мА в течение 16 ч. Гель окрашивают раствором серебра.0 аблиц мер введенитигена Составитель И. Тареева актор М. Петрова Техред М,Ыоргентал Корректор В, Гирнякаказ 3678 Тираж Подписное ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ ССС 113035, Москва, Ж, Раушская наб., 4/5 1 роизводственно.издательский комбинат "Патент", г. Ужго Гагарина, 1 Электрофоретический анализ генома штамма "Минск" показывает, что он содержит 11 сегментов (двухцепочечной Р Н К), которые распределены по классам. Для определения типа миграции их сравнивают 5 со стандартной д 4 я рода РНК вируса Яа 1, которая характеризуется "длинным" электрофоретипом, По типу миграции двух последних сегментов РНК ротавирусов "Минск" и О/а существенной разницы 10 не обнаружено, что позволяет отнести ротавирус человека "Минск" к длинногеномным электрофоретипам,Отмечается существенное различие в электрофоретической подвижности соответственно 3. 4, 6, 7 фрагментов штаммов "Минск" и ЧЧА 1,Формула изобретения Штамм ротавируса человека ГКВ М 2172для получения иммунобиологических препаратов,