Способ выделения микросом из ткани желудка экспериментального животного

)5 601 МЗЗ 48 БРЕТЕНВУ 7,8. ча- еде асти биое при изу- ментной к осом и оводя повыше- етсохраР 450 в ние нен мик ивотному э зонд в оната нана 100 г омывают трикала иьнейшую Цель перед д желудок трия (Йа массы, а средой,3 ед/млдостигаетсяекапитацией в2% растворНСОЗ) из расизвлеченныйодержащей 50гепарина, пос ем, что ж водят чере идрокарб ета 1 мл желудок пр ед/мл коне чего дал ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯПРИ ГКНТ СССР ОПИСАНИЕ И АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬС(71) Ташкентский государственный медицинский институт(54) СПОСОБ ВЪДЕЛЕНИЯ МИКРОСОМ ИЗТКАНИ ЖЕЛУДКА ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОГО ЖИВОТНОГО(57) Изобретение относится к области биохимии и может быть использовано для выделения микросом иэ ткани желудкаживотных. Цель изобретения - повышениефизиологичности способа за счет сохранения активности цитохрома Р 450 и монооксигеназной ферментной системы желудка.Животному непосредственно перед забоем Изобретение относится к облимии и может найти применениении монооксигеназной феристемы желудка. Целью изобретения является физиологичности способа эа с ия активности цитохрома росомах,вводят в желудок раствор натрия гидрокарбоната, Затем животное забивают декапитацией, Быстро извлекают желудок, отсекают пищевод и 12-перстную кишку. В отверстие пищевода шприцем с канюлей вводят среду выделения, содержащую 50 ед/мл контрикала и 3 ед/мл гепарина с рН После этого желудок вскрывают, иэмель ют ножницами и гомогенизируют в ср выделения, состоящей из 50 ед/мл контр- икала, 3 ед/мл гепарина в 0,05 М трис(20% глицерин в 1,15% КС)буфере с рН 7,8, затем гомогенат центрифугируют на ультрацентрифуге при 9000 9 20 мин, надосадок повторно центрифугируют при 1050009 60 мин, Полученный осадок микросом ресуспензируют в среде, состоящей иэ 0,05 М трис(20% глицерин в 1,15% КС)буфера рН 7,8, после чего спектрофотометрически определяют содержание цитохрома Р 450 в микросомах желудка, 1 табл. процедуру выделения ми р р т по прототипу,Способ осуществляется следующим образом.Непосредственно перез забоем животному вводят в желудок через зонд 2% раствор натрия гидрокарбоната из расчета 1 мл на 100 г массы тела, Затем животное забивают декапитацией, быстро извлекают желудок, отсекают пищевод и двенадцатиперстную кишку, в отверстие пищевода шприцем с канюлей вводят среду выделения, содержащую 50 ед/мл контрикала и 3 ед/мл гепарина рН 7,8, после чего желудок вскрывают, измельчают ножницами и гомогенизируют в среде выделения, состоящей10 15 20 25 30 из 50 ед/мл контрикала, 3 ед/мл гепарина в 0,05 М трис-буфере (20 глицерина в 1,15 ЯКС 1) рН 7.8. Затем гомогенат центрифугируют на центрифуге при 9000 ц 20 мин, надосадок повторно центрифугируют при 105000 ц 60 мин, полученный осадок микросом ресуспензируют в среде, состоящей из 0,05 М трис-буфера (20;4 глицерин в 1,15 КС 1) рН 7,8, после чего спектрофотометрически определяют содержание в микросомах желудка цитохрома Р 450.П р и м е р 1, Крыса-самец массой 200 г, За 5 мин до декапитации животному в желудок через зонд введено 2 мл 2 раствора натрия гидрокарбоната, После этого крыса декапитирована. Желудок извлечен, отделен от пищевода и 12-перстной кишки. В просвет желудка введено 5 мл среды промывания, содержащей 50 ед/мл контрикала и 3 ед/мл гепарина, Желудок вскрыт, измельчен, гомогенизирован в среде, содержащей 50 ед/мл контрикала и 3 ед/мл гепарина, путем дифференциального центрифугирования выделена микросомальная фракция, в которой спектрофотометрически определено содержание цитохрома Р 450, составившее 0,06 нмоль/мг белка, а также активность деметилазы амидопирина и НАДФ-Н цитохром-с-редуктазы, составившие 0,147 нмоль НСОН/мг белка/мин и 12 нмоль/мг белка/мин соответственно.П р и м е р 2. Кролик-самец массой 4 кг. За 5 мин до декапитации животному в желудок через зонд введено 40 мл 2 раствора натрия гидрокарбоната. После этого кролик декапитирован. Желудок извлечен, отделен от пищевода и 12-перстной кишки, В просвет желудка введено 50 мл среды промывания, содержащей 50 ед/мл контрикала и 3 ед/мл гепарина, Далее процедура выделения микросом проведена по примеру 1, Содержание цитохрома Р 450 0,101 нмоль/мг белка, а активность ферментов 0,403 нмоль НСОН/мг/мин и 6,48 нмоль/мг/мин.П р и м е р 3. Морская свинка-самец 500 г массой. За 5 мин до декапитации животному в желудок через зонд введено 5 мл 2;4 раствора натрия гидрокарбоната, После этого животное декапитировано. Желудок выделен, в просвет введено 12 мл среды промывания, содержащей 50 ед/мл контрикала и 3 ед/мл гепарина. Далее процедура выделе 35 40 45 50 ния микросом проведена по примеру 1. Содержание цитохрома Р 450 0,049 нмоль/мг белка, а активность ферментов 0,314 нмоль НСОН/мг/мин и 5,0 нмол ь/мг/мин,В таблице приведены данные по активности ряд ферментов и содержанию цито- хрома Р 450 в желудках крыс, кроликов и морских свинок,При выделении микросом желудка по прототипу содержание цитохрома Р 450 не определяется, активность ферментов отсутствует.Положительный эффект обьясняется тем, что благодаря проведению нейтрализации соляной кислоты в желудке перед декапитацией животного и раннему блокированию протеолитических ферментов пу. тем промывания органа до его измельчения и гомогенизации (в отличие от прототипа) средой выделения появляется возможность получить функционально полноценные микросомы желудка, обеспечивающие количественную характеристику цитохрома Р 450 в желудке у животных, что в свою очередь позволяет исследовать монооксигеназную ферментную систему желудка при различных патологических состояниях с целью разработки вопросов патогенеза и оценки эффективности проводимой лекарственной терапии при пероральном приеме лекарств. Формула изобретения Способ выделения микросом из ткани желудка экспериментального животного путем декапитации животного, извлечения желудка, его измельчения и гомогенизации в среде выделения, отделения микросом дифференциальным центрифугированием, о тл и ч а ю щ и й с я тем, что, с целью повышения физиологичности способа, за счет сохранения активности цитохрома Р 450 в микросомах, перед декапитацией животному вводят в желудок раствор гидрокарбоната натрия до нейтрального рН желудка, а перед измельчением желудок промывают средой, содержащей 50 ед/мл контрикала, 3 ед/мл гепарина, 0,05 М трис-буфер, 20- ный раствор глицерина и 1,15-ный раствор хлорида калия рН 7,8.1624318 Активность НАДФ-Н цитохром-се ктаэы нмоль мг минЦитохром Р 450. нмольмг белка Активность деметилазы амидопирина нмоль НСОН мг белка/минк лики и. свинки м. свинки м, свинки к ысы к лики к ысы к лики 6,54 6,5 5.15 4,97 8,7 5.2 ,3 5.7 6,3 4,9 0,197 0,403 0.296 0.395 0.249 0,190 0,415 0,392 0,390 0.281 0,078 0,101 0,095 0,098 0,087 0,106 0,085 0.056 0.087 0.112 0,090+ +0,005 5,7+ М,22 0,321 ф , +О,О 28 Составитель А. АгуреевТехред М. Моргентал Корректор С,Шекмар Редактор О. Спесивых Заказ 184 Тираж Подписное ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР 113035, Москва, Ж, Раушская наб 4/5 Производственно-издательский комбинат "Патент", г, Ужгород, ул.Гагарина, 101 0,052 0,049 0,060 0,070 0,048 0.039 0,045 0,066 0,050 0,044 0.046 0.05 0,067 0,058 0.049 0.061 0.072 0,063 0,054 0,047 0,055 й М,002 0,049 0,065 0,051 0,062 0,047 0,059 0.065 0.072 0.058 0,061 0,078 0,055 0,049 0,047 0056 0.0610,043 0,041 0,02 0,08 ОЛ 56+ М.002 0,264 0,16 0,147 0,200 0.135 0.188 0,211 0,195 0,138 0,172 0,188 0,205 0,147 0,169 0,199 0,181 0.209 0,17 0,191 0,170 0.183+ +0,007 0,314 0,252 0,300 0,196 0,245 0,321 0,189 0,252 0,195 0,229 О,Э 35 0,296 0,285 0,272 0,305 0,198 0,185 0,213 0.244 0,190 0,251 й +0,011 111 10,8 12,0 11,2 13,09,4510,2 11.1 10,2 9.2 8,95 11,1 6,9 9,1 10,2 9.25 9,0 1 1,О 8,7 9,1 10.2 Ы,27