Способ выделения цитохрома c из биомассы дрожжей

(5 12) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕН 2как медицинский препарат при лечении ряда потологий, связанных с кислородной недостаточностью. Цель изобретения - ускорение процесса и повышение выхода целевого продукта, В предлагаемом способе хроматографической очистки цнтохрома С 4 в белковый раствор, содержащий цитохром (С, перед хроматографической очисткой добавляют окислитель - феррицианид калия в количестве 1-1,5 мг на 100 мг цитохрома С и в качестве сорбента используюткарбоксильный кагионит КБТ, В результате получают препарат 99 г,-ной чистоты.1 табл,Ьщ Комитет Российской Федерации по патентам и товарным знакам к авторскому свидетельству(7) Всесоюзный научно-исследовательскийинститут биосинтеза белковых веществ(56) Авторское свидетельство СССР й1563698, кл. А 61 К 35/72, 1987.(54) СПОСОБ ВЫДЕЛЕНИЯ ЦИТОХРОМАС ИЗ БИОМАССЫ ДРОЖЖЕЙ(57) Изобретение относится к биотехнологии, а именно к способам выделения цитохрома С,который может бытьиспользован как биохимический реактив и 1 Ц 1706211 (1 З) Л 12 Х 9/02Изобретение относится к биотехнологии, а именно к способам хроматографической очистки цитохрома С, получаемого путем микробиологического синтеза,Известен способ хроматографической очистки цитохрома С, включающий л 1 еханическую дезинтеграцию дрожжевых клеток, пропускание деэинтеграта через колонку с ионообменной смолой КРК - 1 - 5 п, элюцию цитохрома С со смолы буфером, повторную хроматографию на колонке с ионообменной смолой разведенного элюата и третью стадию ионообменой хроматографии, при этом в результате. последующей гельфильтрации и лиофильного высушивания получают препарат 90 - 95;-ной чистоты, что позволяет его использовать как химический реактив невысокого класса.Наиболее близким к изобретению является способ выделения и хроматографической очистки цитохрома С иэ биомассы дрожжей на ионообмен ной смоле Амберлит ЯС - 50 или смоле Биокарб Д, согласно которому деэинтеграт клеток дрожжей освобождают от клеточных стенок центрифугированием и фракционируют путем ультра- фильтрации последовательно на мембранах 100000, 30000 и 1000 дальтон, выделяя фракцию белков, обогащенную цитохромом С. Полученный на мембране 1000 дальтон концентрат белковой фракции, содержащей цитохром С, хроматографируют на катионите АмберлитЯС, извлекая иэ смеси белков цитохром С, который затем доочищают гельфильтрацией,При разделении белков и пептидов на смоле Амбердит 1 ЯСдостигается высокая специфичность разделения. Однако скорость протекания растворов через колонк с таким сорбентом невелика - 1-1,5 мл/см в 1 мин, что удлиняет процесс очистки,Кроме того, выход целевого продукта недостаточно высок из-за потерь вещества цитохрома С при хроматографической очистке на Амберлите 1 ВС - 50 (10-12 Я.Целью изобретения является ускорение процесса и повышение выхода целевого продукта. Поставленная цель достигается тем, что в способе хроматографической очистки цитохрома С иэ биомассы дрожжей, включающем дезинтеграцию дрожжей, фракционирование путем ступенчатой ультрафильтрации, пропускание через слой сорбента раствора, содержащего цитохром С, и десорбцию цитохрома С буферным раствором, согласно изобретению. в раствор белка перед хроматографической очисткой добавляют феррицианид калия в количестве 1 - 1,5 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 мг на 100 мг хитохрома С, а в качестве сорбента применяют катионит КБТ,Применение ионообменой смолы КБ - 2 Тв качестве сорбента в данном способе позволяет ускорить процесс хроматографической очистки за счет повышения скоростисорбции и десорбции и повысить выход вещества за счет полноты десорбции.Потери вещества при хроматографии наКБ - 2 Т составляют менее 1 о ,Сущность предлагаемого изобретениязаключается в следующем,Клетки дрожжей, выращенных на минеральной среде с эталоном в качестве источника углерода, подвергают механическойдезинтеграции при обработке растворомповаренной соли. Дезинтеграт освобождают центрифугированием от остатков клеточных стенок и фракционируют путемступенчатой ультрафильтрации на мембранах 100000, 30000 и 1000 дальтон, Полученный на мембране 1000 дальтон белковыйконцентрат, содержащий цитохром С, подвергают хроматографической очистке.Хроматографические колонки заполняют сорбентом КБТ, через слой сорбентапропускают белковый раствор, содержащийцитохром С, в который добавляют феррицианид калил в количестве 1-1,5 мг на 100 мгцитохрома С, со скоростью 5 - 12 мл/см в 1мин, что сокращает время сорбции по сравнению с применением Амберлита РЯСв5-8 раз, Сорбированный цитохром С элюируют буферным раствором рН 6,8 - 7,3,При добавлении окислителя менее 1 мгна 100 мг цитохрома С наблюдается неполная сорбция на ионообменнике, а добавление более 1,5 мг экономическинецелесообразно (см. табл,) и ведет к нежелательной сорбции сопутствующих белков.Таким образом, добавление окислителяв белковый раствор, содержащий цитохромС, перед хроматографической очисткой позволяет снизить потери на стадии сорбциицитохрома С, а применение ионообменойсмолы КБТ в качестве сорбента в данномспособе позволяет ускорить процесс хроматографической очистки за счет повышенияскорости сорбции и снизить потери эа счетповышения степени десорбции цитохромаС,П р и м е р 1. Дрожжи РснагпегпЬгапа 1 асепз штамм 8 КМ Увыращивают на минеральной среде следующегосостава: калий фосфорнокислый 3 г/л; аммоний сернокислый 1 г/л; магний сернокислый 1 г/л; натрий хлористый 0,2 г/л;сернокислое железо 0,06 г/л; дрожжевойавтолизат 0,5 г/л; этанол (З=,ь) - в качествеисточника углерода, 1706211П р и м е р 2. Дрожжи Сапбба Отэ штамм ВСБ - 726 выращивают и выделяют белковый раствор, содержащий цитохром С, как описано в примере 1, Смолу КБТ в количестве 30 г (по влажной массе) подготавливают к анализу по примеру 1 и помещают в колонку размером Зх 7 см, заполняя ее нв высоту 5 см катионитом, уравновешенным буфером. В белковый раствор, содержащий цитохром С в количестве 500 мг в 500 мл, вводят 1,2 мг феррицианида калия на 40 45 Клетки дрожжей подвергают механической дезинтеграции при обработке 7 - 15- ным раствором поваренной соли. Полученный дезинтеграт фракционируют путем последовательной ультрафильтрации 5 на мембранах 100000, 30000 и 1000 дальтон.Ионообменную смолу КБ - 2 Т в количестве 10 г (по влажной массе) подготавливают к работе по ГОСТ и помещают в колонку размером 1,2 х 12 см, Смолу уравновешива ют аммонийно-фосфатным буфером рН 6,8- 7,3.В полученный на мембра),з 1000 дальтон белковый раствор объемом 100 мл, содержащий 100 мг цитохрома С, вводят 15 феррицианид калия в количестве 1 мг и пропускают раствор через слой ионообменника со скоростью 10-12 мл/см в 1 мин, извле 2кая иэ смеси белков цитохром С, Затем цитохром С элюируют с колонки 0,25-0,35 М 20 аммонийно-фосфатным буфером рН 6,8-7,3 со скоростью 0,05 мл/см в 1 мин,Чистота препарата, определенная спектральным методом, составляет 80 ф. Такая степень чистоты позволяет получить препа рат 99 ь-ной чистоты при последующей гельфильтрации.В способе, осуществляемом по прототипу, скорость пропускания раствора через сорбент 1-1,5 мл/см в 1 мин, потери веще ства при хроматографической очистке 10- 12.В предлагаемом способе скорость пропускания раствора через сорбент 10-12 мл/см в 1 мин, потери вещества менее 1. 35 100 мг цитохрома С, пропускают через колонку со скооостью 10 - 12 мл/см в 1 мин.2 Полнота извлечения цитохрома С иэ белкового раствора 100. Цитохром С элюируют с колонки по примеру 1 со скоростью 0,10- 0,12 мл/см в 1 мин. Чистота препарата 80- 82. Потери вещества не превышают 1.П р и м е р 3, Дрожжи Сапбба Нгцэ штамм 896 выращивают и выделяют белковый раствор, содержащий цитохром С по примеру 1,Смолу КБ - 2 Т в количестве 50 г (по влажной массе) подготавливают к анализу по примеру 1 и помещают в колонку размером Зх 20 см, заполняют ее на высоту 15 см.В белковый раствор, содержащий 1000 мг цитохрома С, вводят 1,5 мг окислителя - феррицианида калия на 100 мг цитохрома С и пропускают через колонку с сорбентом. Извлечение цитохрома С и десорбцию проводят как описано в примерах 1 и 2. Скорость сорбции 10 - 12 мл/см в 1 мин. Чистота2препарата (80-82) обеспечивает после гельфильтрации получение препарата 99- ной чистоты, Потери вещества не превышают 1.В белковый раствор, содержащий цитохром С вводят окислитель - феррицианид калия и хроматографируют его на квтионообменной смоле КБ - 2 Т, при этом происходит полное извлечение из смеси белков и сорбция цитохрома С, обусловленные применением в качестве сорбента катионита КБТ. Указанная смола позволяет увеличить скорость пропусквния белкового раствора на стадии сорбции в 10 раз по сравнению со смолой Амберлит ЯС.Таким образом, хромвтогрвфическвя очистка цитохрома С с добавлением окислителя - феррицианида калия на карбоксильном катионите КБТ позволяет повысить скорость процесса на стадии сорбции в 10 раз, повысить выход вещества за счет снижения потерь на стадиях сорбции и десорбции до 20, исключить применение импортной ионообменной смолы Амберлит ВСи снизить расходы на смолу в 5 раз.170 б 211 Составитель О.СкоробумоваРедактор В,Трубченко Техред М.Моргентал Корректор 4.Куль Тираж Подписное НПО "Поиск" Роспатента113035, Москва, Ж, Раушская наб 4/5 Заказ 1613 Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул,Гагарина, 101 Формула изобретенияСПОСОБ ВЫДЕЛЕНИЯ ЦИТОХРОМА С ИЗ БИОМАССЫ ДРОЖЖЕЙ, включающий ее дезинтеграцию, фракционирование путем ступенчатой ультрафильтрации, пропускание через слой сорбента белкового раствора, содержащего цитохром С, и десорбцию цитохрома С буферным раствором, отличающийся тем, что, с целью ускорения процесса и повышения выхода целевого продукта, в раствор белка перед пропусканием добавляют феррициэнид калия в количестве 1 - 1,5 мг на 100 мг цитохрома С, а в качестве сорбента используют катионит КБТ,