Способ определения активности антитромбина iii

СОЮЗ СОВЕТСКИХСОЦИАЛИСТИЧЕСКИХРЕСПУБЛИК 1) соиз 101 ЫМЩ 7 К.Б.1 БЛИ ЕНИ ние актив тем, что опредетитромбина 111(х) осущес твляю апиллярн пособомс последующим оп ля гематокрита п ное значение акт 11 Т капиллярной ведения плазмы(у) используют чателькой активн капиллярной кров (7 ) еделением азмы (у). ивности ант рови беэ уч гематокрит для расче сти антитр по Формул ти антитрной доли ктивностисверты 11Целью ние точэобрете ивность и крови сть спо ив ности 93 ФВ ИаС 1д исО,5вят и к областиеления актива системыомбина 111,ется повышеведения ная плаэ- плазво Флае -20 С дующим обба необхо 0,15 ЮаС 1.бина активотразаз, получ анят в силитемператусодерной кон ением разв мой активГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТГО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМПРИ ГКНТ СССР ОПИСАНИЕ ИЗО(71) Белорусский институт усовершенствования врачей и Минский государсвенный медицинский институт(57) Изобретение относится к медицине и касается определения аосновного ингибитора системьвания крови, антитромбина 1изобретения является повышености способа определения актантитромбина 111. Цель достигается 088,8)свидетельство ССС С 01 М 33/86, 198 ПРЕДЕЛЕНИЯ АКТИВНОС Изобретение относится медицины и касается опред ности основного ингибитор свертывания крови, антитрЦелью изобретения явля ние точности способа.Способ осуществляют сл разом.Для осуществления спос димы следующие реагенты,Тромбин 20 ед МТН/мл в Заготовленный раствор тро тивностью 100 ед ЬН/мл х конированных флаконах при ре - 20 С, перед употребл дят 0,15 М ЮаС 1 до требуе кости БО 1562859 А ости анй крови рототипом, покаэате- Конкретитромбинаета раза плазмы та окономбина Т 11 е О,х х - значение активносмбина 111 беэ учета объемлаэмы; у - объемная доля- коэффициент разделения.е позволяет определять акнтитромбина 111 в капилляри существенно повысить точоба. 1 табл. Фиброноген 10 г/л в М(достаточно 5 мл) гото ереследованием.0,15 М раствор ИаС 1 для разреагентов.Контрольная бестромбоцитарплазма - это замороженный пулмы от О доноров. Хранят егоконах по 1 мл, при температурв течение 1 года (без сниженияности. антитромбина 111). Передреблением плазму размораживаютводят 0,15 М ИаС 1 в 10 р107-ную контрольную плазму.Стабилизатор (0,15 М ИаС 1,жащий тринатрийцитрат в конечцентрации 0,05 М).Способ осуществляется следующимобразом,Путем прокола койьем мякоти пальца пациента набирают в микропипетку0,1 мп капиллярной крови и вносятв силиконированную пробирку с 0,7 млстабилизатора, перемешивают и цент"рифугируют при 300 я в течение 5 мин,Берут также кровь дпя получения эна 10чения гематокрита плазмы (у) пообычной методике, После центрифугирования.из пробы берут 0,5 мл опытнойплазмы неизвестного разведения иопределяют в ней активность антитромбина Т 11 по известному способу,В силиконированные пробирки с0,5 мл07. исследуемой контрольной иопытной неизвестной концентрацииплазм добавляют 0,5 мл раствора тромбина. Смесь инкубируют на водянойобане при 37 С и на первой минуте инкубации:встряхивают несколько раздпя образования малообъемного сгустка Фибрина, который можно удалить. 25На 4,6,8,11 и 14 мин инкубации 1:смеси 0,1 мп образовавшейся сыворотки берут пипеткой и добавляют в пробирки с 0,1 мл раствора Фибриногена,По секундомеру регистрируют времясвертывания С Фибриногена остаточнымтромбином сыворотки (забор сывороткиможет быть и при других значенияхно не более 18 мин).Расчет активности антитромбина111 производят по калибровочной кривой по известной методике,Для построения кривых скоростиинактивации тромбина антитромбином111 контрольного и опытного образцов плазмы на миллиметровой бумагеиз полученных в секундах значенийизвлекают десятичный логарифм181 . Кривые скорости инактивациитромбина антитромбином строят дляконтрольного и опытного образцовплазмы в координатах 1 цС с (на осиординат),(на оси абсцисс)Для вычисления активности антитромбина 111 в опытном образце вна 5чале совмещают начальные точки кривых ( если они не совпадают ) с соблюдением угла их наклона, чем вносятпоправку на различное содержаниеантитромбина Т в образцах плазмыи коррегируют ошибку отмериванияобразцов,Любую точку на кривой скоростиинактивации тромбина антитромбином 111 контрольного образца плазмы принимают за 1003 активности антитромбина 1 Т 1. Такая точка взята на 10 мин инкубации смеси. К ней соотносят точку(я 1 О мин) на кривой для опытного образца плазмы капиллярной крови и получают промежуточное значение активности антитромбина 111 капиллярной крови (х), Окончательное значение активности антитромбина 1 П капиллярной крови рассчитывают,учиты-, вая полученное ранее значение гематокрита плазмы (у) по Формуле: активность антитромбина 11 капиллярной+крови =0,1 х (- - ).УПределы нормальных колебаний активности антитромбина 111 капиллярной крови, определенные для донорской группы (20 чел.)составляют 94- 146 Е (х 1 26); 120+2,9% (х+Б ).П р и м е р 1. У пациента 1 исследовали капиллярную кровь предлагаемым способом в динамике (С я = 4,6ИНк 8,11 и 14 мин) и получили значения- 43, 60, 81, 129, 205 с и значения 18 = 1,633; 1,778; 1,908; 2,111 и 2,312 соответственно Для построения калибровочной кривой исследовали контрольную 107,-ную плазму при тех же значениях 1, получилис = = 37, 49, бб, 102 и 157 с и соответственные значения 18 с = 1,568, 1,690, 1,820, 2,009, 2,196.По полученным значениям 18строят кривые для контрольного образца плазмы ф) и для исследуемого образца пациента 1 (П,). После совмещения начальных точек кривых опытного и контрольного образцов и соотношения точек кривых, взятых на 10 мин инкубации, найдено, что промежуточное значение активности антитромбина 11 (х) равно 1 063. Значение гематокрита плазмы (у) пациента 1 равно 0,5, Окончательное значение активности антитромбина 111 капиллярной крови с учетом разведения плазмы опытного образца получают при использовании формулы:активность антитромбина ТТ 1 капиллярной крови у пациента 1 равно7 + у0,1 х ( в ) = 159 Е, что выше нормы.уП р и м е р 2. При исследовании проб капиллярной крови у пациентов 2 и 3 в динамике (й= 4,6,8,11 и 14 мин) получены одинаковые значения ес = 31,38,46,63,86 с и соответствен5 15628 но им значения 1 с= 1,491; 1,580;1,663, 1,799 и 1,934. Однако гематокрит плазмы у пациента 2 равен 0,5, у пациента 3 - 0,57. Внося поправку на различную концентрацию ис 5 следуемой плазмы капиллярной крови пациентов 2 и 3 путем подстановки зназначений гематокрита плазмы в формулу, получаем: активность антитромбина ЕЕЕ капиллярной крови пациента 27 + О 5равна 0 1170 (- -- -) = 1053 чтоЭО 51укладывается в пределы нормы; у пацен 7+057 та 3 равна 0 О 1 70 (- -- ) = 9330,57что ниже нормы.По известному способу определение активности антитромбипа ЕП (АТ-ЕЕЕ) осуществляют в плазме крови без уче та гемоконцентрационных сдвигов, В сосудистом русле кровь осуществляет свои функции, в частности гемостатические, действуя всем своим объемом. Антитромбин ЕЕЕ содержится в плазме 25 крови, объемная доля которой различная в разных образцах крови, Не будет поэтому полного соответствия между выявляемой активностью антитромбина ЕЕЕ в плазме крови и его истинной активностью в единице объема крови без учета объемной доли плазмы крови.С целью повышения точности заявляемого способа исследование проводят в плазме капиллярной крови, дополнительно определяют объемную долю плазмы, активность антитромбина ЕЕЕ без учета объемной доли плазмы и рассчитывают в процентах активность антитромбина ЕЕЕ по формуле АТ-ЕЕЕ7+у=О, 1 х ( -- -), где х - значение акУтивности антитромбина ЕЕЕ без учета объемной доли плазмы, у - объемная 45 доля плазмы крови.В таблице приведены конкретные данные определения активности антитромбина ЕЕЕ в группе (21 человек ) практически здоровых доноров. Функ циональная активность антитромбина ЕЕЕ определялась в плазме крови по известному способу без учета объемной доли плазмы и в тех же образцах по. предлагаемому способу. 55Учитывая выявленные ошибки определения активности антитромбина ЕЕЕ в пробах по известному способу (таблица), найдено, что в среднем на 7,35359 бзаявляемый способ точнее в сравнении с известным.Формула и з о б р е т е н и яСпособ определения активности антитромбина ЕЕЕ путем стабилизации и разведения крови, центрифугирования, добавления тромбина с активностью 20 ед/чл с последующим определением активности антитромбина ЕЕЕ в динамике, о т л и ч а ю щ и йс я тем, что, с целью повышения точности способа, исследование проводят в плазме капиллярной крови, дополнительно определяют объемную долю плазмы, рассчитывают активность антитромбина ЕЕЕ без учета объемной доли плазмы по формулеАТ ПЕ (Е) = О,1 х ( - )7 +У где АТ ЕЕЕ - активность антитромбинаЕЕЕ, 0,1 - объем капиллярной крови;х - значения активности АТ ЕЕЕбез учета объемной доли плазмы;у - объемная доля плазмы;7 - коэффициент разведения. Активность АТпо способуПроба ЕЕЕ,Х, Ошибка по известному способу,7. Из в ест- Предла. аному емому П р и м е ч а н и е. Плюс (+) - результат завышенн; минус (-) - результат занижен,1 112,052 130,953 101,254 97,25 106,656 125,557113,48 182,259 109,351 О 116,111 105,312 110,713 126,914 97,215 13,416 95,8517 122,858 122,8519 122,8520 103,9521124,2 122,22145,5106,56102,29123,11132,13126,0176,43113,1124,37112,8127,78129,0498,84100,2789,9324,92117 ф 7127,0699,06122,18