Способ определения суммарного содержания фибринмономеров и продуктов деградации фибрина в плазме крови

СОЮЗ СОВЕТСКИХСОЦИАЛИСТИЧЕСКИХРЕСПУБЛИК 17796 А 5 ц 5 С 12 0 1/56, 6 3/68 БР О Т АНИ И ПРОДУКТОВ ДЕГРАДАЦИИ ФИБРИНА В ПЛАЗМЕ КРОВИ(57) Использование: медицина, методы определения активности или содержания факторов свертывания или продуктов их превращения в крови. Цель изобретения - повышение специфичности способа, его упрощение и ускорение. Сущность изобретения: спектрофотометрически определяют количество фибринмономера и продуктов деградации фибрина, осаждаемых из плазмы добавкой ристомицина,енныи медицин.Ральнко и,Л,Галян, С И.В,Нелеп сы гоматологии, -48.ЕНИЯ СУММАРНОБРИНМОНОМЕРО встряхивают пробирк ратуре или на холоде вают результат, Появ сгустка рассматривае присутствия в плазм если сгусток появляе нуты. В части случа плазме 50 этанола крупнозернистые час либо как слабоположи бо как отрицательную у при комнатн и через 10 ми ление желео тся как свидее фибринмо тся не позже ев при добав образуется н тицы, что оц тельную реак вует способ вы ров, дополняющ и ротам инсул ьМ/огощэ 1( К. Т 1968. ч. 20, й плазме, обедне бавляют 0,1 мл сульфата, встр мин определяю лазме сгусток и ается как полож аления фибий вышеопиатный тест готЬ. 0 а 1 Ь.12, р. 44): в ной тромбо- % раствора яхивают, че, образовалли гель, чтоительный реСогласно о стабилизируют цитрата натрия роновую кислот центрифуги ров боцитов, к 0,4 плазмы добавл сяли в рассмат эультат,ГОСУДАРСТВЕННОЕ ПАТЕНТНОВЕДОМСТВО СССР(46) 07.12.92, Бюл, М 471) Тюменский госудаский институт(54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛГО СОДЕРЖАНИЯ ФИ Способ относится к биохимии, точнее, к способам исследования активности или содержания компонентов свертывания крови и продуктов их превращения в биологических жидкостях.Известен способ обнаружения фибринмономеров, основанный на том, что при их наличии в плазме после добавления к ней 50 этанола появляется желеобразная масса (В.Г.Л ычев "Анализ и методика распознавания основных нарушений гемостаза и условий формирования геморрагического синдрома при лейкозах" Дисс, на соиск, ученой степени канд, мед, наук. Барнаул, 1975). Желатинизация плазмы рассматривается как признак наличия в ней фибринмономеров. писанному способу, кровь охлажденным раствором содержащим Р-аминокапу(0,1 М), отделяют плазму анием беэ осаждения троммл богатой тромбоцитами яют 0,15 мл 500 зтанола,Сущест ринмономе санный -(Ор 1 пзО В Н ае гпо гги,цитратной цитами, до протамина реэ 10 и 30ои темпен учитыбразного тельство номеров,10-й милении к е гель, а енивают цию, ли 177969310 цина в количестве, создающем его конечную концентрацию в плазме, близкую к деградации фибрина 20 25 30 35 40 45 50 55 Недостатки метода; 1) субъективность в оценке результатов, т,к, появление хлопьев, зернистости и мути не принимается во внимание, а учитывается только крупный сгусток; 2) возможность ложноположительных результатов,В связи с этим, протаминсульфатный тест используется только в совокупности с этаноловым тестом. В итоге, оба указанных метода, используемые порознь или одновременно. отличаются субьективизмом в оценке результатов и не позволяют оценить количество продуктов.Существует и количественный метод определения суммы фибринмономеров и продуктов деградации фибрина (Л.П. Цывкина и И.Л,Маркина В кн,: Актуальные вопросы гематологии. - Томск, 1976, - В. 1. - С, 47-48) путем установления количества фибриногена, осаждаемого ристомицином, Этот метод по технической сущности и достигаемому результату принят нами за прототип, Суть его заключается в том, что определяется разница в содержании фибриногена в плазме до и после обработки ее ристомицином; к 0,1 мл бедной тромбоцитами плазмы добавляют 0,1 мл раствора ристомицина (8 мг/мл), возникший сгусток удаляют, а в плазме затем определяют содержание фибриногена, осаждая его сульфитом натрия или сульфатом аммония, с помощью нефелометрии. Предварительно определяют содержание фибриногена в исходной плазме. Разница в содержании фибриногена до и после осаждения фибринмономеров и продуктов деградации фибрина характеризует суммарное количество фибринмономеров и продуктов деградации фибрина.К недостаткам метода относится: 1. Неспецифичность, обусловленная тем, что в плазму добавляют большое количество ристомицина, которое осаждает не только исследуемые продукты, но и фибриноген, а также тем, что определение количества исследуемых продуктов проводят косвенно, а именно - по разнице между содержанием фибриногена до и после добавления ристомицина.2. Трудоемкость и относительно большая продолжительность анализа, обусловленная; а) необходимостью определять фибриноген два раза; б) использованием для определений способа. включающего осаждение фибриногена и нефелометрическое его определение.Цель изобретения - повышение специфичности, сокращение продолжительности и снижение трудоемкости определения,Поставленная цель достигается в заявляемом способе путем добавления к плазме ристомицина в оптимальном количестве, т,е. в таком, которое осаждает только исследуемые продукты и не осаждает других белков, в частности, фибриногена,Это обеспечивается добавлением ристоми 0,5 мгlмл. Использование экспериментально обоснованного количества ристомицина обеспечивает повышение специфичности способа, т,к. этим путем достигается избирательное осаждение растворимых комплексов мономерного фибрина и продуктов Сокращение продолжительности и снижение трудоемкости достигается тем, что отделившийся после добавления ристомицина осадок растворяют в 1 М едком натрии и непосредственно определяют оптическую плотность раствора, которая позволяет рассчитать суммарное содержание фибринмономеров и продуктов деградации фибрина,Положительный эффект предлагаемого способа по сравнению с прототипом заключается;1. В повышении специфичности, достигаемой; а) тем, что добавление к плазме экспериментально обоснованного количества ристомицина избирательно и специфично осаждает фибриномономеры и продукты деградации фибрнна, не вызывая в отличие от способа-прототипа соосаждения фибриногена; б) тем, что в предлагаемом способе путем спектрофотометрии проводится определение непосредственно исследуемых продуктов, в то время как в способе-прототипе об их содержании судят по степени убыли фибриногена после добавления ристомицина.2. В сокращении продолжительности и снижении трудоемкости, что достигается отказом от двукратного определения фибриногена в исследуемой плазме с помощью нефелометрии, используемых в способе- прототипе, и проведении прямой спектрофотометрии раствора исследуемых продуктов.Способ осуществляется следующим образом;1. 2 мл венозной крови, стабилизированной 3,8 О раствором цитрата натрия (1:9), помещают в коническую пробирку и центрифугируют 15 мин с ускорением 375 9.2. Отделяют 0,5 мл плазмы в сухую пробирку и цинтрифугируют 20 мин с ускорением 1500 9, плазму переносят в сухуюпробирку.3. К плазме добавляют 0,1 мл раствора 5ристомицина (2,5 мг/мл), экспонируют 5мин при комнатной температуре,4. Смесь плазмы с ристомицином центрифугируют 5 мин с ускорением 1500 9.5, Недостаток удаляют и добавляют в 10пробирку 0,5 мл 0,14 М раствора хлориданатрия, суспендируют осадок и центрифугируют 5 мин с ускорением 1 500 9,6, Надосадок удаляют и повторяют промывание физиологическим раствором 2-й 15раз, после чего к осадку в пробирке добавляют 3 мл 1 М раствора едкого натра, помещают в пробирку на 3-5 мин на кипящуюводяную баню - происходит растворениеосадка. 20После охлаждения раствор помещают вкварцевую кювету с рабочей длиной 10 мм, и при 280 нм определяют оптическую плотность против 1 М едкоо натра.Расчет производится по формуле; 25А 280 и Ь 1015,1где С - концентрация фибринмономеров и 30продуктов деградации "фибрина в г/л плазмы;А 28 о - оптическая плотность исследуемого раствора при 280 нм;и - коэффициент пересчета на 1 мл 35плазмы;Ь - коэффициент пересчета с учетомразведения осадка едким натром;10 - коэффициент перехода от концентрации в к г/л; 4015,1 - оптическая плотность 1 раствора фибриногена,Существенные отличительные признаки заявляемого решения,1. Добавление к исследуемой плазме 45ристомицина в количестве 0,5 мг на 1 мл втечение 5 мин обеспечивает выпадениефибринмономеров и продуктов деградациифибрина. Строго заданная концентрацияристомицина обеспечивает специфичность 50способа, т,е. осаждение только исследуемых продуктов.2. Определение фибринмономеров ипродуктов деградации фибрина позволяет оценить их суммарное количество в 55одной пробе, что наряду с использованием прямой спектрофотометрии снижаеттрудоемкость и продолжительность анализа,Изобретение иллюстрируется следующими примерами,Пример 1.а) Кровь у здоровых доноров взяли вшприц со стабилизирующим раствором(3,8 р-р цитрата натрия) в соотношении1;9. Пробы поместили в центрифужную пробирку по 2 мл каждая, центрифугировали сускорением 375 9 в течение 15 мин;б= 0,5 плазмы из каждой пробирки перенесли в сухие пробирки и повторили центрифугирование (1 500 д, 20 мин), затемплазму вновь перенесли в сухие центрифужные пробирки;в) к плазме в каждой пробирке добавили по 0,1 мл раствора ристомицина(2,5 мг/мл);г) после 5-минутной экспозиции пробирки со смесью центрифугировали (1 500 9,5 мин), надосадки удаляли и к осадкам прилили по 0,5 мл 0,14 М раствора хлориданатрия. суспендировали осадки и вновь центрифугировали (1 500 9, 5 мин);д) повторили пункт "г" и удалили надосадок;е) к осадку в каждой пробирке прилилипо 3 мл 1 М раствора едкого натра и поместили пробирки на кипящую водяную банюнд 3 мин,ж) растворы охладили и определили ихоптическую плотность против растворителяпри 280 нм (см.табл,1),Пример 2,а) Кровь трех больных с механическойжелтухой взяли в шприц со стабилизирующим раствором (3,8 ор-р цитрата натрия) всоотношении 1:9. Пробы поместили в центрифужную пробирку по 2 мл каждая, центрифугировали с ускорением 375 9 в течение15 мин.б) 0,5 мл плазмы из каждой пробиркиперенесли в сухие пробирки и повторилицентрифугирование (1 500 9, 20 мин), затемплазму вновь перенесли в сухие центрифужные пробирки;в) к плазме в каждой пробирке добавилипо 0,1 раствора ристомицина (2,5 мг/мл);г) после 5-минутной экспозиции пробирки со смесью центрифугировали (1 500 9,5 мин), надосадки удаляли и к осадкам прилили по 0,5 мл 0,14 М раствора хлориданатрия, суспендировали осадки и вновь центрифугировали (1 500 9, 5 мин);д) повторили пункт "г" и удалили надосадок;е) к осадку в каждой пробирке прилилипо 3 мл 1 М раствора едкого натра и поместили пробирки на кипящую водяную банюна 3 мин;1779693 Таблица 1 Таблица 2 ж) растворы охладили и определили их оптическую плотность против растворителя при 280 нм (см.табл.2),Пример 3.а) Кровь взята у трех белых крыс, которым предварительно ввели в вену тромбин (0,120 мг/100 г массы), т,есоздали экзогенную тромбинемию, что ведет к появлению фибринмономеров и продуктов деградации фибрина, на стабилизатор (3,8 ор-р цитрата натрия) в соотношении 1:9, Пробы поместили в центрифужную пробирку по 2 мл каждая, центрифугировали с ускорением 375 9 в течение 15 мин;б) 0,5 мл плазмы из каждой пробирки перенести в сухие пробирки и повторили центрифугирование (1 500 9, 20 мин), затем плазму вновь перенесли в сухие центрифужные пробирки;в) к плазме в каждой пробирке добавили по 0,1 мл раствора ристомицина (2,5 мг/мл);г) после 5-минутной экспозиции пробирки со смесью центрифугировали (1 500 9, 5 мин), надосадки удаляли и к осадкам прилили по 0,5 мл 0,14 М раствора хлорида натрия, суспендировали осадки и вновь центрифугировали (1 500 9, 5 мин);д) повторяли пункт "г" и удаляли надосадок;е) к осадку в каждой пробирке прилили по 3 мл 1 М раствора едкого натра и поместили пробирки на кипящую водяную баню на 3 мин; ж) растворы охладили и определили ихоптическую плотность против растворителяпри 280 нм (см,табл.3),Формула изобретения5 Способ опреДеления суммарного содержания фибринмономеров и продуктовдеградации фибрина в плазме крови путемобработки плазмы ристомицином, отделения полученного осадка с последующим из 10 мерением оптической плотности ирасчетом, отл и ч а ю щи й с я тем, что, сцелью повышения специфичности способа,его упрощения и ускорения, проводят смешивание плазмы и ристомицина в обьемном15 соотношении 5:1, при этом используют ристомицин в конечной концентрации 0,5 мг/мл,полученный осадок растворяют в 1 М растворе едкого натра, оптическую плотностьопределяют при 280 нм, а количество фиб 20 ринмономеров и продуктов деградациифибрина в плазме С рассчитывают по фор- муле 02 вои Ь 1025 15,1 где 02 во - оптическая плотность растворапри 280 нм;и - коэффициент пересчета на 1 мл плаз мы;Ь - коэффициент пересчета с учетомразведения осадка едким натром;15,1 - оптическая плотность 1 ораство-ра фибринмономера;35 10 - коэффициент перехода от концентрации в ок г/л,1779693 10 Таблица 3 Составитель А, БышевскийТехред М,Моргентал Корректор Л. Филь Редактор С. Кулакова Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул,Гагарина, 101 Заказ 4417 Тираж ПодписноеВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР113035, Москва, Ж, Раушская наб., 4/5