Способ дифференциации штаммов вируса геморрагической лихорадки с почечным синдромом

(51)С ИЯ БРЕТ шков яв- Е Изобрет кой вирусол зовано в л при изучен гемморраги ным синдро Целью и щение и по Примосится к медицинс может быть исполь ние оги ращивают нщтаммами в СС, в на культур ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТРЫТИЯ11 РИ ГКНТ СССРОПИСАНИЕ И ВТОРСИОМУ СВИДЕТЕЛЬСТ(7 1) Белорусский научно-исследовательский институт эпидемиологии имикробиологии(56) Ткаченко Е.А, и др. Применениетвердофазных иммуносорбенных методов(энзимного и радиоиммунологическогоанализа) для лабораторной диагностики аренавирусных инфекций, крымскойгеморрагической лихорадки и геморрагической лихорадки с почечным;синдромом. Метод рекомендации. И., 1982,с, 3-21.Койяег Б.М Но 1 аез 1.Н. - 1, оГчго 1, 1979, ч. 30, р. 839-846.(54) СПОСОБ ДИФФЕРЕНЦИАЦИИ ШТА 2210 ВВИРУСА ГЕМОРРАГИЧЕСКОЙ ЛИХОРАДКИ СПОЧЕЧНЫМ СИНДРОМОМ бораторных исследованиях и вируса - возбудителя еской лихорадки с почечом.(ГЛПС).обретения является упроышение точности способа. е р. Клетки Чего Е-б вы 1 л матрасах, инфицируют руса ГЛПС (например, УФА деленного в лаборатории клеток Чего Е-б из легоч(57) Изобретение относится к меди-. цинской вирусологии и может быть использовано в лабораторных исследованиях при изучении вируса - возбудителя геморрагической лихорадки с почечным синдромом (ГЛПС), Целью изобретения является упрощение и повыше ние точности способа. Цель достигается тем, что клетки инфицируют штаммами вируса ГЛПС, после инфицирования получают цитоплазмазический лизат, из которого путем инкубации с иммунными антителами, фиксированными на сорбенте изолируют специфические рибонуклеопротеидные комплексы (РНП)в характеризующие принадлежность исследуемого материала к роду Хантавирус. ф Экстракцию ДНК проводят из изолированных РНП электрофорезом в полиакриламидном геле, определяют индиви- С дуальную электрофоретическую подвижность геномных РНК, по которой вы ляют сходство ипи различие между 3 авй штаммами ГЛПС, 1 табл,М ной ткани рыжей полевки С 1.я 1 агео 1 цз,отловленной в очаге ГЛПС, н 4590, выделенного на культуре клеток ЧегоЕиз легочной ткани Ар, реппап 1 ае).Инкубируют в среде Игла - 2 ИЕИ с 27"ной эмбриональной сывороткой в течение 8 сут. На 5-е сутки инфицированияв среду поддержки вносят Н -уридинпо 100 мкКи/мп. После окончания инку"бации среду поддержки удаляют, инфицированные клетки используют для получения клеточных лизатов, Затемклеточный монослой промывают холоднойсредой Игла, остатки среды отсасывают и клетки лизируют 0,7 тритона Хв 0,6 М КС 1, 0,05 И - трис НС 1, рН 7,5, с 200 мкг/мл гепарина при 4 С в течение 20 мин. Лизат центрифугируют при 4 С 10 мин при1200 об/мнн, надосадок собирают и используют в реакции иммуносорбции.В качестве сорбента используют взвесь протеин А-сефароэы С 1;4 В, которую перед употреблением трижды отмывают суспендированием в 10-кратных объемах сорбирующего буфера (СВ,0,15 М, ИаС 1, 0,001 М ЭДТА, 0,05 М трис НС 1, рН 8,0) с последующим осаждением на центрифуге при 2000 об/мин в течение 10 мин, После отмывки осадок, суспендированный в солевом буфере (СВ в виде 10 -ной суспензии), смешивают с равным объемом (по 200 мкл)сыворотки крови переболевших ГЛПС людей из Европейской части СССР и с Дальнего Востока и встряхивают в течение 1 ч на холоду, затем инкубируют 25при 4 С 16 ч. По окончании инкубации образовавшиеся иммуносорбеитные комплексы (протеин . А-сефароза - антитело) отмывают дважды СБ с 0,25 альбумина, один раз с альбумином и гепари ном (200 мкг/мл) и используют в реакции иммуносорбции в виде 10 -ной сус;пензии в СБ с альбумином и гепарином.К 200 мкл 10 -ной иммуносорбентной суспензии добавляют по 1 мл осветленного лнзата, смесь инкубнруют 1 ч на холоду, периодически встряхивая. Образовавшиеся комплексы протеин А-сефароза. - антитело - антиген осаждаютпри 5000 об/мин 5 мин. Осадки отмывают дважды СБ, содержащим 200 мкг/млгепарина и 0,05 тритона Х, Вовторой отмывке концентрацию ИаС 1 доводят до 05 И. После отмывки осадки суспендируют в 0,8 мл ЯТЭ (0,1 М НаС 1,450,01 И трис НС 1, рН 7,4, 0,001 М ЭДТА) и отбирают аликвоты для определения кислотонерастворимой радиоактивности.Для контроля на специфичность ре-. акции иммуносорбции рибонуклеопротеидов (РНП) иэ лизатов клеток, инфицированных анализируемыми штаммами вируса ГЛПС, аналогичные операции про-,водят с лизатами иэ неинфицированных55 клеток.Результаты определения специфичности реакции иммуносорбции приведеныв таблице.Клеточные лизаты 503 300 12 220 96 300 18 850 Из таблицы видно, что количество меченого материала, содержащегося в составе РНП в опытных пробах, значительно превьппает его содержание в контрольных пробах. Это свидетельствует об образовании в опытных пробах иммунных комплексов (РНП-антитело). Взаимодействие антител сывороток реконвалесцентов с нуклеокапсидными белками рибонуклеопротеидных комплексов, изолированных из клеток, инфицированных анализируемыми штаммами вируса ГЛПС, подтверждает принадлежность этих штаммов к роду Напйачгцз и свидетельствует о специфичности реакции иммуносорбции. Дляпроведения диФференциации штаммов по индивидуальной электрофоретической подвижности геномных РНК из изолированных РНП экстрагируют РНК. Для этого к иммуносорбентным комплексам, суспендированным в НТЭ, добавляют додецилсульфат натрия до конечной концентрации 1 , проказу с конечной концентрацией 200 мкг/мл и равный объем Фенола, насыщенного НТЭ. Депротеинизацию РНК проводят дважды и РНК преципитируют 2,5 объемами перегнанного этанола. Экстрагированные РНК анализируют электрофореэом.в 2,4 -ном полиакриламидном геле, содержа 1 цемМ мочевины, 18 ч при 100 Ч с последующей обработкой для радиоавтографии.В результате проведенных исследований определено, что геном анализиИэ клеток, инфицированных штаммом СС"1820Из неинфицированных клеток(контроль) Количество меченого материала в составе РНП, изолированных иммуносорбцией,сршФормула изобретения Составитель С,СветлышевРедактор Л.Веселовская Техред Л.Олийнык КорректорМ. Шароши Заказ 951 Тираж 491 ПодписноеВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР113035, Москва, Ж, Раушская наб., д. 4/5 Производственно-издательский комбинат "Патент", г.ужгород, ул. Гагарина, 10 5 156055 руемых штаммов вируса ГЛПС представ-. лен тремя сегментами РНК - Ь, М, 3. Анализ электрофоретической подвижности геномных РНК штаммов 4590 (дорожка 3) и С 6-1820 (дорожка 4) выявил различие между штаммами. Б-сегмент штамма 4590 имел большую электрофоре.тическую подвижность в геле по сравнению с 8-сегментом штамма СС.Таким образом, применяя предлагаемый способ, удалось дифференцировать штаммы вируса ГЛПС, циркулирующие на Дальнем Востоке и в Европейской части СССР, по относительной подвижности их 15 геномвых сегментов, выделенных из внутрицитоплазматических РНП. Способ отличается простотой и эффективностью, Простота достигается тем, что в отличие от способа-прототипа исключаются 20 такие этапы, как очистка и концентрация вируса, связанные с ультрацентрифугированием. Введенные этапы являются менее трудоемкими и не требуют специальной квалификации персонала. 25 ЭФфективность способа заключается в том, что на первом этапе исследования он позволяет сделать заключение о 0 6принадлежности исследуемого материала к роду Хантавирус.Метод может найти. применение также при изучении вирусов, характеризующихся низкой репродуктивной способностью (например, аренавирусов). Способ дифференциации штаммов ви", руса геморрагической лихорадки с почечным синдромом, включающий идентификацию родовой принадлежности вирусов-,изолятов с последующим определением штаммовой принадлежности путем анализа электрофоретической подвижности вирусных геномных РНК, о т л и - ч а ю щ и й с я тем, что, с целью, упрощения способа и повышения его точности, идентификацию родовой при" надлежности нзолятов.вируса осуществляют путем анализа радиоактивности комплекса протеин А-сефароэа - анти- тело с рибонуклеотидами из лизатов культур .клеток,выращенных в присутствии Н -уридина и инфицированных вирусами-иэолятами.