Реактив для определения глицерина фотометрическим методом

СОЮЗ СОВЕТСНИХСОЦИАЛИСТИЧЕСНИХРЕСПУБЛИН НИЯ НТУ У 12йм ГмбХ (ОЕ)Ханс ЗайделРедерПЕ) етение относитсябыть использовано едицин клинии можетческойцерина ровиГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТНРЫТИЯМПРИ П(НТ СССР САНИЕ ИЗО(72) Хельмгард ГаульГунтер Ланг, Альберти Иоахим Цигенхорн(56) Патент ФРГ М 2817087,кл . С 12 Р 13/ 10, 1980. иохимии для определения глриглицеридов в сыворотке Целью изобретения является реактив включающий глицериноксидаэу, характеризующейся более высокой специфической активностью. Указанная цель достигается эасчет использования глицериноксидазыиз Аврег 8111 цв Брес. ПБМ 1729 (микроорганизм почвы), которая была получена с молекулярным весом 90000 испецифической активностью между 2000и 8000 Ч/мг, активность которой снижается под действием БН-реагентов,и на которую не влияет присутствиесерно-кислой меди и уксусно-кислогосвинца,При определении триглицеридов внаале проводится их ферментативный идролиз под действием липаэы и(54) РЕАКТИВ ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ГЛИЦЕРИНА ФОТОМЕТРИНЕСКИМ МЕТОДОМ(57) Изобретение относится к области медицины и может быть использовано в клинической биохимии для определения глицерина и триглицеридовв сыворотке крови, Целью изобретения является повышение специфическойактивности, Для этого используетсяглицериноксидаза иэ Азрег 111 из пресПБМ 1729. эстераэы до глицерина и количествообразовавшегося свободного глицерина определяют с помощью глицсриноксидазы, измеряя либо расход кислорода,либо количество перекиси водорода.Потребление кислорода определяютполяриметрнчески с помощью кислородного электрода, реже используетсягазовая хроматография,Перекись водорода может бытьопределена как титрованием, так ипотенциометрическим, полярографическим и колориметрическим способами,Предпочтительным способом являетсяферментативный способ с применениемпероксидазы, При применении последней в качестве хромогенного вещества(красителя) используют соединения,которые после проведения реакции сфенолом могут быть определены фото/метрически, например 2,2 -аминобензтиаэолинсульфокислота, 4-аминоантипирин, фенилендиаминсульфокислотаметилбензотиазолонгидраэоц и буферный раствор. Кроме этих реагентовдополнительно реактив может содержатьрастворитель, стабилизатор и/или поверхностно-активцые вещества,Предпочитаемыми поверхностно-активными средствами являются Генапол(9, алкилполигликоленый эфир, тритон октилфенолокись полиэтиленаГЮи Брий, а также полиэтиленгликолевый эфир лаурилоного стеарилоного иолеилового спирта.При указанной величине рН 6,88,0 фермент имеет хорошую стойкость,Предпочтительная комбинация реагентов состоит из100-250 КЧ/л (333-833 мг/л) 1 О 15 45 Для проведения определения 2 мл реактива 1 и 0,2 мл реактива 2 вводят пипеткой в кювету, Экстинкцию Е измеряют на фотометре при 546 нм.1Непосредственно после этого инициируют реакцию добавлением 20 мкл пробы, Для определения глицерина н качестве пробы могут быть применены водные среды всех типов, например пищевые экстракты, содержащиеся н организме жидкости, и сыворотка,После проведения реакции в течение 20 мин измеряют экстицкцию Е. Температура выдержки составляет 5 С.о 50 глицерин оксидазы;5-50 КЧ/л (20-200 мг/л)20пероксидазы,0,2-5 ммоль/л (38-955 мг/л)индикатора (4-ацтипирицаминозамещенный),5-50 ммоль/л (64-6400 мг/л)25парахлорфенола;1-5 г/л поверхностно-активного вещества,рН 6,8-8,0 буферного раствора,П р и м е р 1, Определение глицерина по образованию перекиси нодорода. Приготовляют два реактива.Реактив 1.О, 1 ммоль/л триэтацоламинаП р и и е р 2, Кинетическое определение,Проба. Водный стандартный раствор(содержацие глицерина от 10 до100 мг/дл).Реактив0,1 моль/л Ререн-буфера; 1,7 моль/нН ЬО , рН 7,0,3,0 г/л холата натрия;0,5 ммоль - 90 мг/ламицоацтипирина, амицозамещенного;10,0 ммоль/л парахлорфенола (1170 мг/л),10,0 Ч/л (40 мг/л)пероксидазы;121,0 Ч/л403 мг/л глицериноксидаэы,Определение проводят на СещваесЕазС анализаторе-автомате: температура 25 С, длина волны при измереокиях 546 нм, объем пробы 10 мкл;разбанитель (Н О) 50 мкл, объемреактива 500 мкл. Время измерения:первое показание 35 с после начала,второе показание 315 с после началаБыли получены следующие результаты:Пробы (нодцый стандартный раствор),лццерин (ЧЧ-тест),мг/дл Значение глицерина),2105 101 100 101 11 21 32 43 Оценку производят по калибровочной прямой, на которой разность измеренных экстицкпий бЕ = Е -Е стандартцого глицеринового раствора находится в зависимости от концентрации глицерина.Конечная концентрация в исследуемой смеси составляет:45 Ч/мл - 144 мг/л глицериноксидазы;9 Ч/мл - 36 мг/л пероксидазы,0,45 ммоль/лмг/л 4-ацтипирина амицозамещеццого,9 ммоль/лмг/л парахлорфецола,4,3 ммоль/лмг/л холатанатрия,рН 8,0 0,09 моль/л триэтацоламин/Р1554765 6Получены следующие результаты,Проба. Водный стандарт глицерина(45 мг/дл глицерина). 54 10065 9976 9987 9996 102П р и м е р 3. При кинетическомопределении применяют реактив соследующим количественным соотношением компонентов: от 0,05 до0,5 моль/л Р 1 рея-буфера; от 0,5 до2,0 моль/л Н БО ; рН от 6,8 до 8,0;от 1 до 5 г/л холата натрия, 0,25 ммоль/л (38-955 мг/л) 4-амицоацтипирина, аминозамеп 1 ецного, от 5 до50 ммоль/л (640-6400 мг/л парахлорфенола, от 5 до 50 КЧ/л (20-200 мг/и)пероксидазы, от 100 до 250 КЧ/л(333-833 мг/л) глицериноксидазы,Изобретение может быть осуществлено на автоматизированном анализаторе(спектрофотометре), имеющемся в биохимических лабораториях,П р ц м е р 4, Определение глицерина через образование Н О при применении различных аминоз4-амицоантипирина. Осущелогично примеру 1, причесодержит различные амино4-аминоантипнрин (0,5 ммПолучены следующие ре.Проба. Водный стацдар45 мг/дл глицерина.Производное Нахо4-аминоантипиринаФенилендиаминсульфокислотаМВТПО-МВТН4-аминоантипириц (сравнение) 5 Нахождениевновь,7 Поверхностно-активнсевеществоАцетилтриметиламмонийбромидПолиоксиэтилен лауриловый простой эфир(Тергитол МРХ)ТезитДезоксихолат натрияИзотридекацол-полиглико левый простой эфир(Сепаро 1 Х)Холат натрия (сравнение)Формула25 101 103 99100 97,5 99изобретения амещенных Реактив для определения глицериствляют ана- на фотометрическим методом, содержам реактив 1 щий глицерицоксидазу иэ рода Аярегзамещенные 111 ця, пероксидазу, индикатор, пооль/л30 верхностно-активное вещество, буферзультаты: ный раствор, о т л и ч а ю щ и й с я т глицерина тем, что, с целью повышения специфической активности, он содержит глиждение вновь,7 церицоксидазу иэ Аярегд 11 оя РБМ 1729,в качестве индикатора содержит 4-антипирин аминозамещенный и парахлорфенол,35102в качестве поверхностно-активного ве 101щества холат или дезоксихолат натрия,99 а буферный раствор с рН 6,8-8,0 при40 следующем соотношении компонентов,г/л:Глицериноксидаэа иэрода Аярег 8111 ця 0,333-0,833Пероксидаэа Ое 02-0120454-Антипирин аминозамещенный 0,038-0,955Парахлорфецол 0,640-6,400Холат- илидеэоксихолат натрияБуферный растворрН 6,8-8,0 До 1 л Составитель Л. КонюховаТехред П.Сердюкова Корректор О, Кравцова 101 П р и м е р 5, Кинетическое определение глицерина при применении различных поверхностно-активных веществ.Осуществляют аналогично примеру 2, причем реактив вместо 3 г/л холата натрия содержит такое же количество другого поверхностно-активного вещества,1,0-5,0 Редактор Ю. Середа Заказ 467 Тираж 478 П одпис н ое ВН 1 ЯПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР 113035, Москва, Ж - 35, Раушская наб., д, 4/5 производственно-издательский комбинат "Патент", г.ужгород, ул. Гагарина, 101