Способ определения антигенов микобактерий в крови больных туберкулезом

(51)5 А 61 К 39/00 ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕН ТОРСИОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ следовае а Л.ГИсгглютикулезныхзда Фтиз1980,ся тем, нтигено ГОСУДАРСТВЕННЬЭ КОМИТЕТОО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОЗНРЫТИЯМПРИ ГКНТ СССР(21) 3451936/13(56) Романова Р.Ю., Горинаследование реакции агрегатнации для определения тубеантигенов. Тез.докладов сьаторов Закавказья. Ереван,178" 179. Изобретение относится к области медицины и биологии, а именно. к методам иммунодиагностики инфекционных заболеваний. Оно может быть использовано в медицинской практике для диагностики самых различных заболеваний инфекционной природы.Известен способ определения анти- генов микобактерий в крови больных туберкулезом путем исследования сыворотки крови в реакции агрегатагглютинации со специфическими антителами.Однако известный способ недостаточно точен (504), поскольку свободные анти гены в крови выя вляются редко, так как они связаны в иммунные комплексы.Целью изобретения является повы" вение точности определения антигенов микобактерий;Указанная цель достигает что в способе определения а в(54)(57) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АНТИГЕНОВ МИКОБАКТЕРИИ В КРОВИ БОЛЬНЫХТУБЕРКУЛЕЗОМ путем исследованиясыворотки крови в реакции агрегатагглютинации со специфическими антителами, о т л и ц а ю щ и й с ятем, цто, с целью повышения точностиопределения, перед постановкой реакции агрегатагглютинации исследуе"мую сыворотку обрабатывают 0,2 Мглицин-НС 1-буфером при рН 2,0"2,4 втечение 30 мин при 37 С, затем сыворотку пропускают через,сефадекс1-200 и элюируют тем же буфером. микобактерий в крови больных туберкулезом путем исследования сыворотки крови в реакции агрегатагглютинации со специфицескими антителами перед постановкой реакции агрегатагглютинации исследуемую сыворотку обрабатывают 0,2 М глицин-НС 1-буфе" ром при рН 2,0-2,4 в течение 30 мин при 37 С, затеи сыворотку пропускают через сефадекс Си элюируют тем же буфером.Способ осуществляется следующим образом.Производят забор крови обслелуемого больного для получения сыворотки. Проводят диссоциацию циркулирующих иммунных комплектов (ЦИК), Осуществляют определение антигенов реакцией агрегатагглютинации.Диссоциацию циркулирующих иммунных комплексов с последующим опре" делением антигенов проводили с использованием 0,2 М глицин-НС 1-буфе- .1123128 физиологическим раствором от ГЛАсмешивают с 1 мл агрегированнойсыворотки, внося навеску бикарбоната натрия до 24-ной конечной концентрации, Смесь инкубируют 90 мин при56 оС, после чего сенсибилизированные эритроциты отмывают трижды Физиологическим раствором, ресуспендируют в 10 мл физиологического раствора, добавляют мертиолат 1:10000 ихранят при 4 С до использования. Поостановку реакции агрегатагглютина"ции проводят в агглютинационных 15дисках микротитратора "Такачи" на0,2-ной нормальной кроличьей сыворот.ке. бе результаты учитывают после 30 35 40Использование колонки размером251,0 см является достаточным дляхроматографии 0,5 мл сыворотки.П р и м е р 1, Больной К-в по" 45 ступил в отделение дифференциальнойдиагностики с подозрением на туберкулез легких, У больного взято 2,5 млкрови для исследования, из которойобщепринятым способом получают сыворотку (1,0 мл) . При постановке комплекса иммунологических тестов необнаружено противотуберкулезных антител. Титр антигена в сывороткепри постановке реакции агрегатагглютинации с эритроцитами, обработанными иммунной сывороткой против микобактерий туберкулеза, 1:8 (нижедиагностического титра реакции 1;32) .У больного, не обнаружено антигенов, ра рН 2,0-2,4, который добавляли киспытуемой сыворотке крови (1:1),После инкубации в течение 30 мин при37 ф С образцы наслаивали на колонкуи уравновешивали этим же буфером,Дальнейшее разделение проводили путем гель-фильтрации на сефадексеС=200,Элюацию проводят этим же 0,2 Мглицин-НС 1-буфером. Собирают фракцию (по 1 мл) и после нейтрализации бикарбонатом натрия каждую изсобранных фракций исследуют на содержание бактериального антигенав реакции агрегатагглютинации, азатем вычисляют суммарный титр антигена (по всем пробам).При постановке реакции агрегатагглютинации сыворотку больного (там,где ищут антиген) добавляют к взвеси эритроцитов, обработанных глютаральдегидом (ГЛА) и агрегированной иммунной сывороткой противмикробов-возбудителей болезней 25легких, В этой реакции при определении антигенов используют эритроциты человека 0(1)группы КЬ-.Эритроциты, отмытые от сывороточныхбелков и консерванта Физиологическим раствором рН 7,0 (до полногоотсутствия реакции на белок с 503"ной трихлоруксусной кислотой в промывной жидкости), суспендируют вдвукратном объеме Физиологическогораствора и добавляют к ним 251-ныйраствор ГЛА. После трехчасовой инкубации при 37 ОС эритроциты отмывают 4 раза физиологическим растворомресуспендируют в нем же и вновь добавляют ГЛА до 0,254-ной концентрации (для хранения в активированномсостоянии), Для агрегации на эритроцитах отбирают сыворотки, полученные иммунизацией кроликов убитойкультурой каждого из микробов: пневмококка (1, 11 и 111 серотипов),патогенного стафилококка и гемолитического стрептококка, разрушеннойкультурой живых микобактерий БЦЖкоторые со своим специфическимантигеном в реакции преципитациидавали титр не менее 1:18. Для поликонденсации к 1 мл этой сывороткидобавляют 0,08 мл 1,5-ного раствора ГЛА на Физиологическом раствореи инкубируют в течение 1 ч при 37 С.о1 мл 8 Ф-ной взвеси стабилизированных эритроцитов после отмывания добавления к сыворотке больного сенсибилизированных эритроцитов и ин"кубации в течение 3 ч при 37 С. Исключение любого из вышеуказанных приемов не позволит получить ии" кобактериальные антигены. Изменение вышеуказанных приемов, например замена глицин-.НС 1-буфера на Фосфатный, изменение полной силы буфера, изменение рН буфера и кислую или щелочную сторону, использование сефадекса с другими размерами частиц, изменение условий и температуры, контакта сыворотки крови с глицин-НС 1-буФером, количества полученных проб, не позволяет получить или приводит к резкому снижению количества получаемых вэлюате микобактериальныхантигенов, как показано в табл.1-4.Следовательно, наиболее оптимальным является рН 2,0 и до 2,4.стрепто-, стафило- и пневмококка.Произведена диссоциация иммунныхкомплексов в сыворотке, К 1 мл испытуемой сыворотки крови добавляют1 мл 0,2 И глицин-НС 1-буфера рН 2,Йи инкубируют 30 мин при 37 С дляразрушения иммунных комплексов. Дальнейшее разделение разрушенных иммунных комплексов проводят на колонке 250 х 10 мм с сефадексом С.Для этого сыворотку с глицин-НС 1-буфером после инкубации (1:1) наслаивают на колонку и уравновешивают темже буфером. После того как испытуемая сыворотка прошла через колонку,ее элюируют этим же глицин-НС 1-буфером в количестве 12 образцов (Фракций), каждая объемом 1 мл. Таким образом, из 1 мл испытуемой цельнойсыворотки получают 12 фракций.Для определения содержания в каждой Фракции бактериального белка вРАГ необходимо нейтрализовать их бикарбонатом натрия до нейтрального рН.Затем определяют конечный титр реак"ции на бактериальный белок в каждой из 12 фракций испытуемой сыворотки. Складывают показатели в каждой фракции и получают суммарныйтитр содержания антигена яо .всемФракциям (пробиркам) .Поскольку вначале сыворотку разводят в два раза глицин-НС 1-буфером,суммарный титр удваивают и получаюттаким образом окончательный ответ осодержании бактериального антигенав сыворотке больного путем разрушения специфических циркулирующих иммунных комплексов,Постановку реакции агрегатагглюВтинации проводят в агглютинационныхдосках микротитратора "Такачи" на0,2-ной кроличьей сыворотке. Фракции разводят 1;4, 1:8, 1;16, 1;32,1:61 и т.д, Далее к ним добавляетобработанные глютаровым альдегидом и специфической иммунной сывороткой против разрушенных микобактерий ВСЖ (титр сыворотки в реакциипреципитации 1:16) эритроциты и инкубируют в течение 1 ч при 37 С, после чего учитывают результат реакции,Титр антигена при постановке реакции агрегатагглютинации с иммуннойсывороткой против микобактерий ту беркулеза после диссоциации иммунных комплексов у больного повысился до 1:128, антигены стрепто-, ста 50 циации ЦИК титр стафилококкОВОГО 5 10 15 20 25 30 35 40 45 фило- и пневмококков у него по-прежнему не обнаруживались. В дальнейшем при обследовании и по результатам лечения диагноз туберкулеза у -данного больного был подтвержден. Таким образом, в данном случае путем диссоциации иммунных комплексов у больного в сыворотке обнаружены антигены микобактерий, что является прямым указанием на инфицирование микобактериями туберкулеза, Следовательно, уже в период поступления в стационар, когда диагноз туберкулеза был неясен, было получено указание на этнологию заболевания.П р и м е р 2. Больная Б. поступила в диагностическое отделение с диагнозом: обострение простого (катарального) бронхита, а больной Д, - с диагнозом: обострение хронического обструктивного бронхита. При обследовании мокроты у больной,Б, был выделен пневмококк, а у больного Д. посев оказался стерильным. При первом иммунологическом обследовании не было выявлено никаких антител в обоих случаях. Методом прототипа - РАГ - у больного Б. были зарегистрированы свободные антигены патогенного стафилококка и пнев-. мококка в титрах 1:18 . При диссоциации ЦИК титры этих антигенов возросли соответственно 1:96 (в 6 раз) и 1;1 М (в 9 раз), Это дало основание предположить, что к пневмококку в процессе обострения присоединился патогенный стафилококк. После прове; денной антибактериальной терапии на-, ступила ремиссия болезни с полной ликвидацией антигенов стафилококка и пневмококка иа крови как свободных,так и из ЦИК.У больного Д. при обострении обструктивного бронхита были также об-. наружены свободные антигены патогенного стафилококка и пневмококка в крови в титрах 1:16 и 1: 8, причем слабо выражен последний. При диссоантигена увеличился в четыре разе(1:ЬЦ, а титр пневмококкового ан"тигена был 1:16, ниже диагностического титра для антигенов из ЦИК(1:32). Это дало возможность сделать заключение о ведущей роли вданном обострении патогенного стафилококка, а пневмококк в настоящиймомент не участвовал как этиологи 7 11231ческий фактор, так как имелись лишьего следы в кровиВ результатепроведенной антибактериальной терапии в стадии ремиссии у данногобольного свободные антигены отсут 5ствовали, а антигены стафилококкаиз ЦИК были зарегистрированы в титре 1:32 (диагностический титр), антигены пневмококка как и прежде втитре 1;16 отсутствуют.Необходимо отметить, что еслипри ремиссии простого бронхита антигены сразу же исчезают из крови,то в стадии ремиссии обструктивногобронхита антигены в ЦИК могут определяться длительно, до М-б месяцев,указывая на этиологический факторданного заболевания,20Необходимо указать и на прогностическое значение определения антигенов из ЦИК, особенно в процессе лечения, при длительных, хронически текущих заболеваниях легких. Набла далась, например, группа больных Фиброзно-кавернозным туберкулезом в Фазе распада, впервые выявленного. При активном лечении свободные анти" гены из крови, как правило, исчезают. З 0 У больных с плохой клинико-рентгенологической динамикой или со стабилизацией туберкулезного процесса антигены из ЦИК есть всегда и в больших титрах, часто при отсутствии свободных антигенов. В то же время в ,группе больных с хорошей клиникорентгенологической динамикой при полном заживлении каверны происходит полная элиминация туберкулезных антигенов иэ крови. В ЦНИИ туберкулеза Минздрава СССР обследованы больные туберкулезом, главным обрзом инфильтративным с 45 распадом и фиброзно-кавернозным в стадии обострения (53 чел.), хроническими пневмониями и бронхитами (бб чел.) .Результаты исследований представлены в табл.5.. 50В результате диссоциации иммунных комплексов у 48 человек (из 53 обследованных больных туберкулезом) выявлены туберкулезные антигены в титре выше установленного нами на здоровых 55 лицах диагностического титра (1;32). У 23 человек, у которых обнаруживались и свободно циркулирующие тубер 28 8кулезные антигены в крови, титры воз- росли в 1 чраза (у 25 больных до диссоциации антигены в крови вовсе не выявлялись. В среднем чувствительность метода возросла в 10 раз. У больных хроническими пневмониями .и бронхитами также в 10 раз возросла чувствительность реакции при определении пневмококковых антигенов (при диагностическом титре 1:25), почти в 9 раз - при определении антигенов гемолитического стрептококка (диагностический титр 1:32), в 7 разпри определении антигенов патогенного стафилококка (при диагностическом титре 1:32).Таким образом, преимущество предлагаемого способа заключается в определении антигенов микобактерий туберкулеза в сыворотках больных, в котоГьх они не определялись. Число таких больных возросло в зависимогти от формы болезни в 1,7-3,2 раза, в увеличении титров бактериальных антигенов, что повысило чувствительность реакции по сравнению с прототипом в 7-19 раз; проведение эффективной противотуберкулезной или антибактериальной терапии в ряде случаев снижало титры антигенов в ЦИК, а при полном обратном развитии туберкулезного процесса или ремиссии хро-нических заболеваний легких (ХНЗЛ) они вообще не определялись. Это свидетельствует о прогностическом зна" чении определения антигенов из ЦИК, обнаружение из ЦИК антигенов пневмококка, стафилококка или гемолитического стрептококка при хронических заболеваниях легких позволило более точно определить этиологический Фактор заболевания, являющийся непосредственным возбудителем заболевания или обострения ХНЗП самостоятельно или в ассоциации с другими микробами. Следовательно, определение бактериальных антигенов из ЦИК повышает эффективность диагностикивсопалительных заболеваний легких,которая заключается в уточнении диаг"ноза заболевания, особенно в техслучаях, когда показатели других иммунологических тестов находятся впределах нормы,10 1123128 Таблица 3 Таблица 1 Получение микобактериальныхантигенов в титрах при изменении рН глицин-НС 1-буфера 0,2 Мв сыворотке больного туберкулезом М Выход микобактериальных антигенов при.изменении температуры контакта сы" воротки больного с глицин- НС 1-буфером Титры полученного анти- гена Антигены в титрах рН О Температура контакта в градусах15 Табли ца 2 Получение ми коба кт ериал ьныхантигенов в титрах при измененииионной силы глицин-НС 1-буферапри рН 2,0 контакта и размеровчастиц сефадекса и числа пробв элюате в сыворотке больноготуберкулезом М 25 Таблица Выход микобатериальных антигенов в титрах при изменениивремени контакта сывороткибольного с глицин-НС 1-буферомпри с 37 С Изменение какого-либо,условия получения антигенов при сохранении всехостальных параметров Титрантигена 30 Время контакта, мин Титры анти- генов Ионная сила буфера Размер частиц сефадекса Число .проб элюата 8 12 14 45Таблица 5Содержание антигенов микробов в свободном видеи в циркулирующих иммунных комплексах убольныхтуберкулезом, пневмониями и бронхитами Антигены.Показатели Средняя геометрическая титра (М+в) Среднийтитр Доверительный интервалв 1 в и титрах) 1:7,64 0,883+0,08 0,643-1,12 титры 1:4- 1:13,21123128 12Продолжение табл,5 еевееввеее евеееевее в ее е е е е е е е е е в е е а в Ф Ф т е е ав е а а Антигеню Показатели Средняя геометрическая титра (Иа) Доверительный интервалв 1 В и тите,рах)е в а е ее ве а е е е ев Ев в е ваввеет ееав е е е Ев в а в е Е в ае е е В иммунных комплексах 1; 70,7 1,85+0,077 1. 5,04 Свободные вкрови Пневмококк 1:49,4. 1,69+0,1 В иммунных комплексах Свободные в 1 е 8крови Патогенныйстафилококк 158,4 1,770;68 В иммунных комплексах 1 еб Свободные вкрови Гемолитический стрептококк 1:52,8 В иммунных комплексах 1,72+0, 14 Свободные в 3:4крови Здоровыелица 0,90+0,08 О:,66-1,04титры 1:4,6 е1 25 Т:8 В иммунных комплексах ее а а е а в и ае е в е е в е е а а е е а а и е е е е Ф е е в в ав е е ав в а е в в в ее в Ф е е ее ав е е е в е в е а е ае е е е в а а ее а е Ф ТехРед А,Кравчук Корректор С.йекмар Редактор Офилиппова иаааеагавиеиаааеигееиавваагеевааииеаииаааааааееавивватаагаагаа Заказ .792 Тираж ПодписноеВНИИПИ Государственного комитета по изоабретениям и открыгияма при ГКНТ СССР113035 Иосква, Ж"35, Раушская наб:д. 4/5ага витати иветтаиага та титеагата г ге ага вагитавиа гаа а ивага та та г авиаа тПроизводственно-издательский комбинат "Патент", г.ужгород, ул.Гагарина, 191 аеев" Фее Средний титрЕвввВ1,62 е 2,08титры 1,"41,6 Ф1:.2,020,072 Л,19 ; 0 ф.13-1 ф 27титры 1:1,351:18,6 1,39 е 1,99титры 1:24,8 е1:97,7О,9 Е+0,19 . 0,33-1,47Титры 1:2,14 е1:29,51,53-2,01титры 1:33,9 а1:102,30,8030,266 0,031,63титры 1.1-1:6 1,30-2, 1титры 1;20"1:1380,51 е 0,69титры 1;3 р 2 в1:4,9