Способ определения холестерина

(57) Использовтивный анализ ЕДЕЛЕНИЯ ХОЛЕСТЕ С:пособаются в ОСУДАРСТВЕННОЕ ПАТЕНТНЕДОМСТВО СССРГОСПАТЕНТ СССР) ВТОРСКОУУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ ние; медицина, фермента Цель изобретения - повь Изобретение относится к области ферментативного анализа и может быть использовано в клинических исследованиях придиагностике атеросклероза, диабета, мочекаменной болезни, функциональных расстройств печени и некоторыхинфекционных заболеваний,Известен способ определения холестерина, основанный на измерении скоростивыделения пероксида водорода. Определение холестерина данным способом, которойпо своей сути наиболее близок к заявляемому изобретению, выполняется следующимобразом, Аликвота исследуемого образца,например, сыворотки крови, вносится в измерительную кювету спектрофотометра, содержащую реакционную смесь следующегосостава:Буферная смесь 0,1 М, рН 5-9Субстраты пероксидазыСоли желчных кислот 1 - 20 мМ,Неиснные детергенты - 0,1 - 10 г/лХолестеринэстераза 100 - 30000 ед/лХолестериноксидаза 100 - 30000 ед/л 51)5 6 01 й 33/48, 33/92, С 12 0 1/60, 1/28, 1/46 шение точности способа, Сущность изобретения: процесс осуществляют в две стадии, на первой из которых ведут обработку образца при температуре 20-55 С в течение 2 - 20 минут реагентом, содержащим холестеринэстеразу, буферную смесь и детергент, при этом происходит гидролиз этерифицированного холестерина, На второй стадии осуществляют окисление холестерина с помощью холестериноксидазы и регистрацию скорости образования пероксида водорода. Регистрацию ведут фото- метрическим методом. Пероксидаза 2500 ед/л,Далее проводят регистрацию измененияоптической плотности при температуре 2040 С в течение 2 - 15 мин,Недостатки рассматриваемого сопределения холестерина заключаследующем,Оптимальные условия проведения реакций гидролиза и окисления не идентичны(не совпадают оптимум рН, температурныйоптимум, концентрации детергентов), чтоприводит к использованию больших количеств ферментов.сПроведение определения холестеринарассматриваемым способом основано наодновременном проведении 3-х последовательных реакций. Исходно в исследуемыхобразцах содержится как этерифицированный, так и неэтерифицированный холестерин, причем соотношение этих формхолестерина может меняться в зависимостиот сыворотки, Кроме того, скорость гидролиза этерифицированного холестерина холестеринэстеразой зависит от длины истепени насыщенности остатка жирной кислоты, Поэтому начальная скорость образования пероксида водорода зависит не 1 олько от общей концентрации холестерина, но и от соотношения разных форм холестерина в образце, что приводит к снижению достоверности определения,Целью изобретения является повышение точности определения.Поставленная цель достигается предложенным способом, заключающимся в том, что исследуемую пробу добавляют в водную среду инкубации состава: не менее 0,01 М буфера с рН 6,5-8, не менее 5 г/л холевокислого натрия и не менее 10 ед/л холестеринэстеразы, инкубируют при температуре 22 - 55 С не менее 2 мин, после чего аликвоту инкубационной смеси вносят в измерительную кювету спектрофотометра, содержащую не менее 0,01 м/л буфера с рН 6,5 - 8, не менее 2 г/л холевокислого натрия, не менее 0,3 ед/л пероксидазы, не менее 0,5 ед/л холестериноксидазы, не менее 0,08 г/л 4-аминоантипирина и не менее 0,03 г/л 8- оксихинолина, с последующей спектрофотометрической регистрацией скорости реакции образования пероксида водорода.Предлокенный способ отличается от известного порядком проведения операций, а именно, разделением стадии гидро- лиза и экстракции со стадией окисления, что дает возможность осуществлять гидролиз в оптимальных условиях при температуре 25- 55 С не менее 2 мин, а также соотношением реагентов в гидролизующей и окисляющей смесях.Эти отличия позволяют повысить точность определения и существенно сократить расход реагентов,П р и м е р 1. Образец сыворотки (0,02 мл) вносят в пробирку с реакционной смесью (0,2 мл), содержащей 0,01 М К-фосфатного буфера рН 7,0, холевокислого натрия 10 г/л, 30 ед/л холестеринэстеразы из поджелудочной железы. Параллельно в раствор того же состава вносят 0,02 мл стандартного раствора холестерина (5 мМ), Пробы инкубируют 10 мин при 45 С, Затем из каждой пробирки отбирают по 0,1 мл реакционной смеси, вносят в спектрофотометрическую кювету, содержащую 0,7 мл раствора следующего состава: 0,03 М К-фосфатный буфер, рН 7,0, 5 г/л холевокислого натрия, холестериноксидазу (5 ед/л), пероксидазу (20 ед/л), 4-аминоантипирин (0,16 г/л), 8-оксихинолин (0,20 г/л). Для каждого из образцов измеряют начальную скорость изменения оптической плотности в течение 2 мин при длине волны 50025 П р и м е р 3. Условия эксперимента аналогичны условиям в примере 1, за исклю 30 35 40 45 50 55 5 10 15 20 нм, Результаты измерений приведены втабл, 1,Концентрацию холестерина рассчитывают по уравнению:холестерин = /х 5,0 мМ,Чслгде холестерин) - концентрация холестерина в исследуемой пробе;Чхол - скорость изменения оптической плотности для исследуемой пробы;Чст - скорость увеличения оптической плотности в случае стандартного раствора холесте рина,П р и м е р 2, Условия проведения эксперимента аналогичны таковым в примере 1, за исключением того, что при анализе стандартной сыворотки (5 мМ) используют различные значения рН при проведении первой стадии реакции гидролиза, Результаты измерений приведены в табл, 2,Из полученных данных следует, что оптимальные значения рН для проведения реакции гидролиза составляют 6,5 - 8,0 чением того, что используют различные концентрации холевокислого натрия в гидролизующей смеси. Результаты измерений приведены в табл. 3.На основании данных, приведенных в табл, 3, оптимальная концентрация холевокислого натрия в гидролизующей смеси составляет не менее 5 г/л,П р и м е р 4. Условия проведения эксперимента аналогичны таковым в примере 1, за исключением того, что изменяют температуру при которой проводится гидролиз (табл, 4).Из данных приведенных в табл, 4 следует, что полный гидролиз этерифицированного холестерина достигается при температуре 20 - 55 С при концентрации холестеринэстеразы из поджелудочной железы в гидролизующей смеси 2 мг/мл (активность холестеринэстеразы 0,03 ед/мл),П р и м е р 5. Условия измерения те же, что в примере 1, за исключением того, что изменяют концентрацию холестеринэстеразы в гидролизующей смеси. Данные предста влен ы в табл, 5, На основании данных, приведенных в табл. 5, оптимальная концентрация холестеринэстеразы составляет не менее 10 ед/л при температуры 45 С и времени гидролиза 10 мин.П р и м е р 6, Условия проведения реакции аналогичны таковым в примере 1, за исключением того, что изменяют состав ре1788466 55 акционной смеси для проведения реакции окисления холестерина: (табл. 6), варьируя концентрацию холевокислого натрия,Таким образом, оптимальная концентрация холевокислого натрия в реакционной смеси при окислении холестерина составляет не менее 2,0 г/л,П р и м е р 7. Условия проведения эксперимента такие же как в примере 1, но изменяется концентрация 8-оксихинолина. Результаты измерений представлены в табл, 7 получены для стандартной сыворотки с концентрацией 5 мМ,Таким образом, оптимальной концентрацией 8-оксихинолина является не менее 0,3 г/л.П р и м е р 8, Условия измерения те же, что в примере 1, за исключением того, что изменяют концентрацию 4-аминоантипирина, Данные, измеренные для стандартной сыворотки 5 мМ, приведены в табл 8.Из данных, приведенных в табл, 8, следует, что оптимальной концентрацией 4- аминоантипирина является концентрация не менее 0,08 г/л,П р и м е р 9. Условия эксперимента те ке, что в примере 1, за исключением того, что изменяют концентрацию пероксидазы в реакционной смеси. Данные приведены в табл. 9.Полученные данные показывают, что оптимальной концентрацией пероксидазы в реакционной смеси является не менее 0,3 ед/л.П р и м е р 10. Условия эксперимента те ке, что в и. 1, за исключением того, что все сыворотки параллельно измеряют и по способу прототипа, а при измерении по заявляемому способу используют концентрации холестеринэстеразы и холестериноксидазы те же, что в прототипе1 ед/мл, При измерении по способу прототипа к 20 мкл образцов сывороток добавляли 2 мл смеси следующего состава:0,1 М фосфатный буфер рН 6,78,6 мМ трибромгидроксибензойная кислота1,6 мМ 4-аминоантипирин3 мМ холевокислый натрий0,1 % полиэтиленгликоль 60000,1 % трезит 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 1000 ед/л холестеринэстераза1000 ед/л холестериноксидаза2500 ед/л пероксидазаИнкубировали при 30 С и через 2 минуты регистрировали фотометрически скорость образования пероксида водорода. В эксперименте использовались следующие контрольные сыворотки; фирмы "Воейгп 9 ег ааппйеа" Ргеср Е 1 (концентрация холестерина 8,5 мМ), фирмы " аЬзуыет" погщг (концентрация холестерина 3,7 мМ), зеросопс Р (концентрация холестерина 4,7 мМ, фирмы "Нуапб" паталогическая (концентрация холестерина 5,0 мМ). Результаты измерений приведены в таблице. 10.Из приведенных в табл, 10 данных следует, что при измерении по способу-прототипу полученные результаты зависят от состава липопротеидных комплексов в сыворотках крови, а при измерении по заявляемому способу точность результатов во всех сыворотках одинакова, что свидетельствует о большей точности предложенного способа.Формула изобретения Способ определения холестерина, включающий инкубацию исследуемой пробы в среде, содержащей буфер, субстрат пероксидазы, соль желчных кислот, холестеринэстеразу, холестериноксидазу и пероксидазу и последующую спектрофотометрическую регистрацию скорости образования перекиси водорода, о т л ич а ю щ и й с я тем, что, с целью повышения точности способа, исследуемую пробу добавляют в водную среду инкубации, содержащую буфер с рН 6,5 - 8,0 в концентрации не менее 0,01 М, холевокислый натрий в концентрации не менее 5 г/л, холестериноксидазу не менее 10 ед/л, инкубируют не менее 2 мин при 25 - 55 С, затем аликвоту инкубационной смеси вносят в измерительную кювету, содержащую буфер с рН 8,0 - 8,6 в концентрации не менее 0,01 М, холевокислый натрий в концентрации не менее 2 г/л, пероксидазу не менее 0,3 ед/л, холестериноксидазу не менее 0,5 ед/л, 4- аминоантипирин в концентрации не менее 0,08 г/л и 8-оксихинолин в концентрации не менее 0,03 г/л.1788466Табпица 1 Таби бли цапи х12 1788466 Таблица 9 Табл и ца 10 Корректор Э. Лонч дак оизводственно-издательский комбинат "Патент", г, Ужгород, ул,Гагарина, 101 з 71ВНИИ оставитель Н.Угар ехред М.Моргентал Тираж ПодписноеГосударственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР113035, Москва, Ж, Раушская наб., 4/5