Способ определения никотинамидадениндинуклеотида окисленного

СОЮЗ СОВЕТСКИХСОЦИАЛИСТИЧЕСКИХРЕСПУБЛИК 3557 2 0 1/6 МИТЕТ ССС Й И ОТКРЫ ВЕННЫИ ИЗОБРЕ ГОСУДАРСПО ДЕЛ САНИЕ ИЗОБРЕТЕНИ Во 1 ц- .1 ече 1 з ипшоЪеш. 1982,АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВ(56) ИепЬацвеп 6 Эе 1 цса М. шдпезсепг азваув о 2 р 1 сошо 1 е о 2 чагоцв шегаЬо 11 гев цвхпа 11 гей епзушез. - Апа 1, В 1 осЬе 127, У 2, р, 380-388.Мее 1 гоу М, О., ПеЬцсс 1 М. А. Регей 1 у апй Ъасгег 1 а 1 1 цшдпезсепсе. - 1. Арр 1, ЬосЬеш. 1983,. В 5, р. 197-203,Тишков В, И. Формиатдегидрогенаэа метилотрофных бактерий; иммобилизация и свойства иммобилизованного фермента,: Тез. докл. ТЧ Всесоюзного симпозиума "Инженерная энзимология", 11, 1983.(54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ НИКОТИНАМИДАДЕНИНДИНУКЛЕОТИДА ОКИСЛЕННОГО (57) Изобретение относится к области биохимического анализа, касается способа ферментативного количественного определения никотинамидадениндинуклеотида окисленного (НАД+) и может быть использовано для анализа НАД+ в сложных смесях и различных биологических жидкостях. Цель изобретения - снижение предела обнаружения НАД+. Способ осуществляет ся путем регистрации интенсивности биолюминесценции, возникающей в результате протекания трехстацийной реакции, каталиэируемой трехферментной системой, включающей НАД+-зависимую дегидрогеназу, НАДН ФМН-оксидоредуктаэу и бактериальную люциферазу. Для проведения анализа к суспензии соиммобилизованных фер- С ментов в буферном растворе при рН 6-7, отвечающем рН оптимуму действия трехферментной системы, добавляют суб- фаей, страты всех используемых ферментов и анализируемый раствор, содержащий НАД+, Предел обнаружения НАД сос- р тавляет 10 "М в измеряемой смеси. 1 табл, 1 133Изобретение относится к биохимическому анализу, касается способаферментативного количественного определения никотинамидадениндинуклеотица окисленного (НАД+) и может бытьиспользовано для анализа НАД в сложных смесях и различных биологическихжидкостях,Пель изобретения - снижение предела обнаружения НАДСпособ осуществляется следующимобразом,Регистрируют интенсивность биолюминесценции, возникающей в результате протекания трехстадийной реакции, каталиэируемой трехферментнойсистемой, включающей НАД-зависимуюдегидрогенаэу, НАДН : ФМН-оксидоредуктазу и бактериальную люциферазу,Ферменты предварительно соиммобилизуют на сефарозе, активированнойбромцианом в присутствии 03 М формиата натрия. Изменение концентрацииформиата натрия по сравнению с укаэанной приводит к снижению удельнойактивности иммобилизованных ферментов и чувствительности определенияНАД, Для проведения анализа к суспензии соиммобилизованных ферментовв буферном растворе при рН 6-7, от. -вечающем рН оптимуму действия трехферментной системы добавляют субстраты всех используемых ферментови анализируемый раствор, содержащийНАД , Предел обнаружечия НАД + 10 Мв измеряемой смеси,П р и м е р 1, Лиофилизованную ВтСМагароэу 4 В замачивают на 3 ч в дистиллированной воде, Полученный гельпромывают последовательно 1 мМ раствора НС 1 (200 мл НС 1 на 1 г геля),200 мл бидистиллированной воды, 0,1 Мбикарбонатным буфером, содержащим0,5 М ЫаС 1, бидистиллированной водойи О,1 М Г 1 а-фосфатным буфером,Готовят 3 мл раствора ферментов:формиатдегидрогеназы из бактерийРзецйотпопаз Вр 101, Ф ВКМ ВД -институт Микробиологии АН СССР,НАДН:ФМН-оксидоредуктазы и люциферазы иэ бактерий Бепес 1 еа Ьагчеу 1.в 0,1 М Г 1 а-Ьосфатном буфере, рН 795 фс концентрацией белка 3 мг/мл и активностью 1000 мВ/мг белка, К полученному раствору добавляют 200 мгносителя и формиат натрия до концентрации 0,3 М. Суспензию перемешиваютн качалке 20 ч при 4 С. Полученные5570 У =0,51 х 5,8,55 с, 10 15 20 25 30 35 40 45 50 образцы отмывают попеременно кислыми (100 мл) и щелочными (100 мл) компонентами 0,1 М Г 1 а-фосфатного буферного раствора до исчезновения ферментативной активности в промывных водах, Отмытые образцы суспендируют в5 мл 0,1 М Г 1 а-фосфатного буфера, рН7,0, содержащего 0,1 мМ дитиотреитол,ои хранят при 4 С, Удельная активностьполученных препаратов 200-1000 мВ/мг,П р и м е р 2, Иммобилиэацияпроводится так же, как в примере 1,но инкубационная смесь содержит0,25 М формиат натрия, Удельная активность получаемых препаратов 20100 мВ/мг агарозы.П р и м е р 3, Иммобилизацияпроводится так же, как в примерено инкубационная смесь содержит0,35 М формиат натрия, Удельная активность получаемых препаратов 40200 мВ/мг агарозы,П р и м е р 4, Для получения калибровочного графика в интервалеконцентраций 1 пммкМ используютодну и ту же пробу иммобилизованного препарата, В кювету люминометравносят реагенты, укаэанные в таблице, за исключением НАД и измеряютфоновое свечение, Затем последовательно вносят по 20 мкл раствора НАД+в концентрациях 0,125, 1,25, 12,5,1250, 12500 нМ, переходя от меньшихконцентраций к большим, и каждый разизмеряют интенсивность биолюминесценции, В данном .эксперименте при добавлении раствора НАД используют небольшие объемы (20 мкл). Поэтому непроисходит существенного разбавления реакционной смеси и измененияконцентрации реагентов при добавлении нескольких порций НАД в одну иту же реакционную смесь.В таблице дан состав реакционнойсмеси при проведении регистрацииНАД+Калибровочная кривая представляетсобой прямую в интервале концентраций НАД+ 1 пМ,1 мкМ, Калибровочнуюпрямую обрабатывают по методу наименьших квадратов, Получают уравнение где У = 1 д (интенсивность свечения)х=2 д (концентрация НАД),Повторяют определение, вводя в реакционную смесь 20 мкл 125 нМ НАЛ,Получают интенсивность свеченияИсходная концентрация,нМ Реагент 10 0,1 0,25 ФМН в воде Деканаль в 27-номизопропаноле 20 0,1 0,5 Формиат натрия вводе 150 0,1 3,75 НАД+ в 50 мМНаН РО,1, рН 5,5 0,1 1000 25 Суспензия: 40 мг иммобилизованного ферментного препарата в 1 мл 0,1 М Иа-фосфатного буфера, рН 7,0 1,6 10 мВ/мл 410 ф мВ/мл О, 1 50 мМ На-Фосфат,ный буфер, рН 6,5 2,0 Составитель Л, Борисова Техред В.Кадар Корректор А, Обручар Редактор И. Горная Заказ 40 18/22 Тираж 499 ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж, Раушская наб., д, 4/5Подписное Пр,л 1 эээопс гваээцо-полиграфическое предприятие, г. Ужгород, ул. Ирм к э ээ,эя13355 15,7 мВ что соответствует концентрации НАД в реакционной смеси 0,91 ф х 10 э М. Ошибка определения 97П р и м е р 5. Калибровочную кривую для определения НАД при рН 7,0 получают так же, как в примере 4, используя 50 мМ На-фосфатный буфер с рН 7,0. Линейная зависимость между концентрацией НАД и интенсивностью свечения соблюдается в пределах 10 пМ - 0,1 мкМ НАД+,П р и м е р 6. Калибровочную кривую для определения НАД+ при рН 6,0 получают также, как в примере 4, используя 50 мМ Ма-фосфатный буфер с рН 6,0 вместо 6,5. Линейная зависимость между концентрацией НАД+ и интенсивностью свечения соблюдается в ,пределах 5 пМ,1 мкМ НАД+. 70 4 Формула изобретенияСпособ определения никотинамидадениндинуклеотида окисленного, предусматривающий регистрацию биолюминесценции, возникающей в результате трехстадийной реакции, катализируемой трехферментной системой, получаемой соиммобилизацией НАД+-зависимой дегидрогеназы, НАДН. ФМН- оксидоредуктазы и бактериальной люцифераэы, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что, с целью снижения предела обнаружения, в качестве НАД -зависимой дегидрогеназы используют формиатдегидрогеназу, процесс соиммобилизации ведут в присутствии 0,3 М формиата натрия и регистрацию осуществляют при рН 6-7.