Способ получения изолированных клеток печени

СОЮЗ СОВЕТСНИХСОЦИАЛИСТИЧЕСКИХРЕСПУБЛИН А 1 1 4 19) 04 С 1235/О ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ СССРПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЫТИЙ ПИСАНИЕ ИЗОбР Н АВТОРСКОМУ СВИ ЕТЕЛ У х клет логии ание и ние в изо- Цитоло 45-551.(54) СПОСОБ КЛЕТОК ПЕЧЕ 57) Изобрет ологии и можклеточной би ой медицине яется увелич(21) 39494 (22) 17.06 (46) 15.05 (71) Инсти и криомеди (72) А.Х.Б А.1 О.Петрен (53) 578.0 (56) Канаеокислитель лированных гия, 1975,6/31-138587, Бюл. В 18ут проблем криоцины АН УССРлоус, Н,П.Суббоо и А.Н.Сукач5.23(088.8)а И,П, и др. Дьое фосфоилировклетках печени.т. 17, У 5, с. ЧЕНИЯ ИЗОЛИРОВАННЫХ ние относится к биотехет быть использовано в логии и экспериментальЦелью изобретения явение выхода жизнеспособ Щфпс."НИЯ ц,гч,ечени с повьппеннои сте пенью сопряжения дыхания и фосфорилирования, Предложенный способ получения изолированных клеток печени заключается в том, что извлекают печень декапитированного животного, после перфузии органа раствором бенкса без кальция и глюкозы, затем печень разрезают на кусочки размером 1-3 мм2 и осуществляют дезагрегацию путем вибрации частотой 50-90 Гц в течение 30-90 с. Данный способ позволяет получить 987. жизнеспособных клеток печени (при общем количестве 58 млн. клеток на 1 г печени) с высокой степенью сопряжения дыхания и фосфорилирования (отношение скорости эндогенного дыхания, стимулированного разобщителем 2,4-динитрофенолом, к скорости эндогенного дыхания составляет 4,2)4 табл.0426 Т а б л и ц а 1 Способ Количество клеток, млн Количество неповрежденных гепатоцитов (7 от общего количества клеток) изг пе- чени из органа 15 Известный 50,0+2 240+40 92+1,2 Предлагаемый 58,0+2 586+7 98+0,4 Таблица 2 Способ Энд ЧНф Известный 8,1 18,3 4,3 Предлагаемый 2,32+0,3 10,9+0,9 4,8+0,3 4,2 1,8 1 13Изобретение относится к биотехнологии, и может быть использовано вклеточной биологии и экспериментальной медицине.Цель изобретения - увеличение выхода жизнеспособных клеток печени сповьшенной степенью сопряжения дыхания и фосфорилирования.Способ получения изолированныхклеток печени иллюстрируется следующими примерами.П р и м е р 1, Вскрывают брюшнуюи грудную полости декапитированнойкрысы массой 200 г,-нижнюю полую вену перевязывают вьппе места ответвления правой почечной вены и перевязывают дистальнее лигатуры, нижнюю полую вену надсекают в месте впаденияее в предсердие. В просвет сосудавводят инъекционную иглу и с помощьюперистальтического насоса проводятпромывание печени 200 мл промывногораствора Хенкса без кальция и глюкозы. Печень извлекают из грудной полости и разрезают на кусочки размером1-3 мм, затем переносят в сосуд устройства, содержащий 10 мл растворасостава 250 мМ сахаровы, 5 мМ КС 10,4 мМ КНРО, 0,4 мМ ИаНРО , 2 мМдитиотреитола, 1 мМ ЭДТА, 0,8 мММяС 1 и 17 альбумина. рН раствора 7,4,Далее включают электродвигатель идезагрегируют кусочки печени при озвратно-поступательном движении пестика с частотой 50 Гц и амплитудой5 мм,.Дезагрегирование осуществляют втечение 60 с, Полученную суспенэиюклеток фильтруют через 4 слоя нейлона и осаждают при 1500 об/мин в течение 1,5 мин, Полученные клетки дваждыпромывают раствором.Жизнеспособность клеток определяютпо их окрашиванию в 027.-ном растворевитального красителя трипанового синего,2Подсчет жизнеспособных клеток осуществляют в камере ГоряеваРезультаты опытов по определению выхода жизнеспособных гепатоцитовФ представлены в табл. . Выход жизнеспособных клеток и = 7,Данные, представленные в табл, 1,показывают, что выход жизнеспособныхклеток печени по предлагаемому спо 30 собу увеличивается на 67 по сравнению с известным,Сопряженность дыхания и фосфорилирования исследуют полярографически, определяя скорость эндогенного35 дыхания (Ч и ), скорость эндогенного3 Ндыхания, стимулированного разобщителем 2, 4-динитрофенолом (Ч ДНФ),скорость окисления сукцината-субстрата в норме не проникающего через40 плазматическую мембрану (Ч ),Результаты опытов по эффективности окислительного фосфорилирования получаемых клеток печени представле ны в табл. 2, (Сопряжение окисленияи фосфорилирования и = 6). Чсчкп . Ч,дйфЧсукц, /Чнд ЛундТаблица 3 Выход клетокиз ткани,млн ЖиэнеспособВыход жизнеспособВремявоздействия ность 7ных клеток на 1 г печени, млн 30 98+2 40,0+4,8 320,0+38,4 90 97+3 44,0+5,4 352,0+26,2 Таблица 4 Функциональнаяактивность(ЧДНФ/Чэнд) Выход жиз- неспособных Жизне- способЧастотавибрации,Гц Выход клеток из ткани,млнклеток на1 г печени,млн 70 98+2 58,2+7,4 576+72 90 98+2 56,8+7,2 537+64 4,1+0,5 4,0+0,4 Формула изобретения повышения выхода жизнеспособныхклеток с повышенной степенью сопряжениядыхания и фосфорилирования, дезагрегации подвергают предварительно измельченную печень, а дезагрегациюпроводят с помощью вибрации с частотой 50-90, Гц в течение 30-90 с,Способ получения изолированных клеток печени путем извлечения органа, его перфузии, дезагрегации и отделения целевого продукта, о т л и - ч а ю щ и й с я тем, что, с целью.Составитель М.СероваТехред М.Ходанич Корректор С.Иекмад Редактор И.Сегляник Заказ 1868/26 Тираж 500 Подписное ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж, Раушская наб., д. 4/5,Цанные, представленные в табл. 2 свидетельствуют, что полученные клетки характеризуются прочным сопряжением процессов дыхания и фосфорилирования (отношение Ч нф/Ч ц, равно 4,2, что в 2,2 раза выше, чем в известном способе). Косвенная оценка проницаемости плазматической мембраны клеток по скорости окисления непроникающего субстрата сукцината свидетельствует 1 О о меньшей проницаемости плазматической мембраны по сравнению с известным способом (отношение Чс /Ч равно 1,8 по предлагаемому и 1,3 по извест ному способам). 15П р и м е р 2. Способ осуществляют, как описано в примере 1. Время 26 4дезагрегации 30 с и 90 с, а частота вибрации 70 Гц и 90 Гц.Результаты исследований представлены в табл. 3-4.