Способ определения деструкции эндоплазматического ретикулума клеток печени

(5) С ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИК АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ 8 Бачманова,дина, О.В.ДобИ.Г.Савин,дена Ленина нский инсти Методы аргичес(71) 2-й Московский оргосударственный медицитут им. Н.И.Пирогова(54) (57) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ДЕСТРУКЦИИ ЭНДОПЛАЗМАТИЧЕСКОГО РЕТИКУЛУМАКЛЕТОК ПЕЧЕНИ путем исследованияактивности ферментов, о т л и ч а ющ и й с я тем, что, с цепьюповышения специфичности способа, в гомогенате клеток печени определяютскорость инактивации цитохрома Р и при увеличении ее уровня по сравнению с нормой определяют деструкциюэндоплазматического ретикулума.1 11428Изобретение относится к биохимиии экспериментальной медицине и можетнайти применение как скрининг-тестдля выявления повреждений мембраныэндоплазматического ретикулума пе 5чени при моделировании заболеванийпечени и оценке эффективности действию гепатотропных лекарственныхсредств.Известен способ оценки состоянияплазматических мембран печени по выходу в кровь Ферментов цитозоля клеток печени (альдолазы, аминотрансферазы, лактатдегидрогеназы и др.), на.ступающего при разрушении плазматических мембран 1,Однако указанный способ не харак-.теризует состояние внутриклеточныхмембран, в частности мембран эндоплазматического ретикулума, в которых локализованы Фермелтные системы,ответственные за детоксицирующуюфункцию печени. И наконец, Ферменты,появляющиеся в крови при разрушенииплазматических мембран печени, необладают абсолютной специфичностьюдля печеночной ткани. Активностьэтих ферментов в крови может возрастать и при повреждении других органов и тканей, например при поражениимиокарда, поперечно-полосатой мускулатуры, почек и др.Цель изобретения - создание скри-нинг-теста, специфичного для повреждения мембран эндоплазматическогоретикулума печени, позволяющеговыявлять повреждения мембран на ранних стадиях заболевания.Указанная цель достигается тем,что согласно способу определения деструкции эндоплазматического рети 40кулума клеток печени путем исследова.ния активности Ферментов, в гомогенате клеток печени определяют скорость инактивации цитохрома Рипри увеличении ее уровня по сравнениюс нормой определяют деструкцию эндоплазматического ретикулума,Способ осуществляют следующим образом.Кусочки ткани печени в 0,5-1,0 ггомогенизируют в 6 мл 100 мМ тис;НСбуфера, рН 7,6 полученный гомогенатпомещают в кюветы спектрофотометра,через опытную кюцету в течение 1 минпропускают окись углерода, в обе кюветы добавляют по несколько кристаллликов дитпонита натрия и при 37 Св т"е.;", 30 мин с интервалами по 02 2 5 мин записывают спектры поглощения комплекса восстановленной формы цитохрома Рс окисью углерода в интервале длины волн 400-500 нм.Скорость инактивации регистрируют спектральными методами и оценивают изменение разницы поглощения при 420 и 450 нм (ЬА 4 нм). Полученные ре. зультаты сравйивают со скоростью инактивации в неповрежденной печени и при скорости инактивации выше, чем в контроле, устанавливают повреждение мембран эндоплазматического ретикулума.П р и м е р 1 . Повреждения мембран печени крыс вызывали введением животным внутрибрюшинно фенобарбитала (8 мг/100 г веса) в течение 3 дн. Контрольным животным внутрибрюшинно вводили физиологический раствор. Каж дая из групп состояла из десяти животных. Через 24 ч после прекращения введения фенобарбитала животных забивали декапитацией. В гомогенатах из печени на спектрофотометре "Хитачи" регистрировали скорость инактивации цитохромаРпо4 о,нмЧерез 30 мин после восстановления цитохрома Рдитионитом натрия в гомогенатах печени контрольных крыс в спектре поглощения отмечается максимум при 420 нм, характеризующий переход цитохрома Рв неактивную форму - цитохром Р. При сравнении скорости инактивации цитохрома Рв гомогенатах из печени контрольных и получавших фенобарбитал животных выявляют деструкцию мембран эндоплазматического ретикулума фенобарбиталом, о чем свидетельствует резко выраженное возрастание скорости инактивации цитохрома Р.П р и м е р 2. Повреждения мембран печени крыс вызывали введением жи вотным внутрибрюшинно гелиотрина (30 мг/100 г веса) однократно.Контрольным крысам внутрибрюшинно вводили физиологический раствор. Через 24 ч животных забивали декапитацией. Скорость инактивации цитохрома Рв гомогенатах печени регистрировали аналогично примеру 1. Повреждение мембран эндоплазматического ретикулума гелиотрином сопровождается резким возрастанием скорости инактивации цитохрома Р.Таким образом, регистрация скорости инактивации цитохром Р3 1142802 4в гомогенатах печени может быть ис- перименте - при моделировании заболепользована как скрининг-тест для вы- ваний печени и исследований зффектив. явления повреждений мембран эндоплаз- ности действия гейатотропных лекарст матического ретикулума печени в экс- венных средств.Составйтель И.ЕмельяненкоРедактор М.Келемеш Техред Т.Фанта Корректор О, БилакЗаказ 731/40 Тираж 897 Подписное ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж, Раушская наб., д. 4/5 Филиал ППП "Патент", г. Ужгород, ул. Проектная, 4