Способ получения изолированных клеток печени

(57) Изобретение относится к биотехгии нологии и может быть использовано вклеточной биологии и экспериментальдриенко, ной медицине. Цель изобретения - понко вышение Функциональной активностиизолированных клеток печени. Для получения гепатоцитов перфузию органаР проводят в два этапа раствором Локка,причем на втором этапе в растор вводят ЭДТА, а дезагрегацию проводят с помощью ультразвука в среде, содержащей хлористый кальций. 4 табл биоло о ССС 1985 Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано вклеточной биологии и экспериментальной медицине,Целью изобретения является повышение Функциональной активности изолированных клеток печени.П р и и е р 1, Перфузию печениживотных весом 200-250 г проводятдп вСи. Для этого вскрывают брюшнуюполость анестезированных животных,вводят инъекционную иглу в воротнуювену и закрепляют лигатурой,а нижнююполую вену надсекают в месте ответвления правой почечной вены для оттока перфузата. На первом этапе отмывку печени от крови проводят раствором Локка (рН 7,6) в течение О 15 мин прн температуре раствора 37Состав раствора Локка, г/л:Хлористый натрий 9,00Хлористый калий 0,42 г/л: 6,000 0,372 стый калийрнокислый калийамеще нныйрнокислый натрий Фо 0,054 ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТПЭ НЗ ООВВЮ и ОНРИтиГВэИ ГКНТ СССР(71) Институт проблем крии криомедицины АН УССР(56) Авторское свидетельс1310426, кле С 12 Н 5/О Лимоннокислый натрий 7,90 Двууглекислый натрий 0,30 Глюкоза 1,80 Дистиллированная вода Остальное Раствор пропускают со скоростью 25 мл/мнн в течение 10-15 мин (объем 250-350 мл). На втором этапе перфузию проводят раствором Локка, в который вводят 2 мХ ЭДТА (рН 7,4).Перфузию осуществляют с той же скоростью, расход перфузата 6 СО мл, Общее время перфузии 30- 40 мин. После окончани перфузии печень извлекают из брюшной полости, измельчают ножницами в сахарозной среде, содержащей 1,2 мИ.Состав среды дезагрегацииСахароза 8Хлоридвузамещенный 0,071Хлористый магний0,076Хлористый . кальций 0,180Альбумин 10, 000Дистиллированная вода ОстальноеДезагрегацию осуществляют, с помощью вибрационного устройства при часготе 50 Гц в течение 60 с. Полученную суспензию фильтруют через нейлон 10проводят очистку первичной суспении гепатоцитов серией отмывок длядаления поврежденных клеток. Послетого полученные клетки ресуспендирут в среде 199 с таким расчетом, чтоы получилась оптимальная концентраия 1-3 х 10 кл/мл (объем 150-200 мл),Количество неповрежденных клетокпределяют методом окраски трнпановым синим (0,4 Ж).20Функциональную активность (уровень эндогенного дыхания, стимуляции эндогенного дыхания 1-5 мМ сукцинатом, содержание адениннуклеотидов) определяют как свежевьщеленных кле ток, так и после культивирования (в суспензии).Результаты опытов по определению выхода гепатоцитов (п = 10) приведены в табл. 1. 30Данные, представленные в табл. 1, свидетельствуют о том, что предлагае.мый способ позволяет получить жизнеспособные клетки печени,:которые не теряют своей Функциональной активнос 35 ,ти и после культивирования в суспензии в среде 199.Клетки, получаемые по известному способу, прокрашиваются трипановым синим на начальных этапах культивирования.В табл. 2 представлены биохимические показатели Функциональной полноценности клеток (и = 10), полученных по известному и по предлагаемому способам.Из табл. 2 видно, что уже на этапе вьщеления клетки характеризуются высоким эндогенным дыханием (в 5,2 раза превышает данные известного спо соба)Дыхание не изменяется в процессе двухчасового культивирования в условиях суспензии. Сукцинат (1-5 мМ) в норме, не проникающей через плазматическую мембрану, в 1,б раза меньше стимулирует эндогенное дыхание по сравнению с известным способом. Куль- ф тивирование клеток, полученных по изобретению, не изменяет степень стимуляции эндогенного дыхания сукцинатом. Коэффициент дыхательного контроля сукцината (Ч , /Ч щ) не превышает 1,33 у свежевьщеленных, в то время как для культивированных клеток он несколько ниже.У полученных гепатоцитов при культивировании способность сохранять высокое содержание АТФ, значительно возрастает и достигает величин, харак-терных для перфузируемой печени, что также является подверждением высокой Функциональной активности получаемого материала.П р и м е р 2. Способ осуществляют аналогично примеру 1, но с тем отличием, что перфузию печени осуществляют только раствором Локка (без добавления ЭДТА на втором этапе) (табл. 3).Из табл. 3 видно, что перфузия печени раствором Локка, не содержащим хелатирующего агента ЭДТА, приводит к значительно меньшему выходу Функционально полноценных клеток (в расчете на влажный вес печени).П р и м е р 3. Способ осуществляют аналогично примеру 1, но с тем отличием, что дезагрегацию клеток проводят в сахарозной среде, используемой в прототипе (без СаС 1).Результаты приведены в табл. 4 (и = 4).Из табл. 4 видно, что при дезагрегации клеток в среде, используемой в известном способе, количество в жизнеспособных клеток резко снижается.Формула изобретенияСпособ получения изолированных клеток печени, включающий перфузию органа с последующей его дезагрегацией в сахарозной среде с помощью вибрации, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что, с целью повышения функциональной активности клеток, перфузию органа проводят в два этапа, раствором Локка, причем на втором эта" не в раствор Локка вводят ЭДТА в количестве 2 мМ, а среда дезагрегации содержит хлористый кальций в количестве 1,2 мМ.Способ на вес на 1 г пепечени чеки Свежевы- После куль" деленные тивирования Известный 586117 58,0+2,0 Предлагаемый 236120 26,34,0 Т а б л и ц а 2 Способ Чцид (нМО м хО кл/мин)сзкц / ЭНД Ч ук (нИОх1 Оф кл/мин) Содержание АТФ;нМ на 10 фкл. веже- Культиыде- вировеже- Куль ыде- виро веж енные ва леннь ные ванные. Известнь Раствором Локка одиозтапно 78,5+0,8 8+2,5 Предлагаемый 236,02,0 9112,0790/31 Тира Государственного к113035, " ЗакаВНИИП 0 Подписное тиям при ГКНТ ССС митета по изобретениям и открь сква, Ж, Раушская наб., д. но-издательский .комбинат "Патент", г.ужгород, ул. Гагарина, 10 Нро водс Известый 2,30,Колич функц ультииро- анные собПр едласпособ 9810,4.91+2,0 спо 5мый2 3+0,594 ф 1,8 Свежевы- Культиви-.деленные рованные