Штамм вкм в-1458-продуцент лизин-2-монооксигеназы

(59 4 С 12 Ы 9/04, 1/20 // (С 12 Х 9/04, С 12 К 1:3 КОМУ СВИДЕ ГЕЛЬСТВУ КА СУДАРСТВЕННЬ 1 Й КОМИТЕТ СССРО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИИ ОПИСАНИЕ ИЗОБР(57) Изобретение относится к микробиологической промышленности. Цель изобретения - выявление нового штамма бактерий Рве(и 1 ошопав риЫа, обладающего повышенной активностьюлизин-монооксигенаэы, и удешевление целевого продукта, Штамм отобранпри сканировании микроорганизмов рода Рвеийошопав, хранящихся в ВКМ.Штамм проявляет максимальную активность при культивировании на жидкойпитательной среде, содержащей 3-4 г/длизина или технического лизина, втечение 45 ч, равную 30,.1 Е/г биомассы. Посевным материалом служит куль"тура продуцента возрастом 60 ч.0427 ВКМ В/В/ ВКМ В/В/ ВКМ В/В/ ВКМ В/В/ Ряецс 1 ощопаярцгЫа ВКМ В/В/ ВКМ В/В/ ВКМ В/В/ ВКМ В/В/ Ряецс 1 ощопая К 1 цогеясепя ВКМ В-/В/ВКМ В/В/ 45 50 55 Ряецс 1 ощопая Г 1 цогеясепя 70/314 1 131Изобретение относится к микробиологической промышленности, а именнок получению ферментов микробного происхождения и представляет собой штаммбактерий - продуцент фермента лизин-монооксигеназы /КФ 1,3.12.2/ /ЛМС/,который может быть использован в микробиологической и медицинской промьшленности, а также в медицине,Цель изобретения - выявление нового штамма бактерий Ряецс 1 ощопая рцг 1 с 1 а, обладающего повышенной активностью лиэин-монооксигенаэы и удешевление целевого продукта.Штамм отобран при сканированиимикроорганизмов рода Ряецс 1 ощопая,хранящихся в ВКМ и во ВНИИ сельскохозяйственных микроорганизмов г. Ленинграда:Ряецс 1 ощопаяГ 1 цогеясепя 70/314 71/405Лизин-монооксигенаэная активность обнаружена при культивировании на жидкой синтетической среде, содержащей Е-лизин в качестве единственного источника углерода и азота в количестве 3-4 г/л в условиях аэрации в штаммах:РяецстощопаяГ 1 цогеясепя ВКМ В/В/ Ряецс 1 ощопаярцс т.са Наибольшей активностью обладает штамм Ря. рцгЫа ВКМ В/В/, имеющий следующие культурально-морфологические и физиолого-биохимические свойства: время генерации в МПБ 60- 70 мин; клетки грамотрицательные, палочкообраэные, размером 1-3 мкм, подвижные, двигаются с помощью полярных жгутиков, бесцветные, при ферментации выделяют в культуральную жидкость пигмент зеленого цвета - пиовердин. На МПА после 24 ч инкубации 10 15 20 25 30 35 40 при 25 С образуются округлые колонии диаметром 2-3 мм беловато-серые, непрозрачные, гладкие блестящие с правильными краями. В центре колонии образуется небольшая выпуклость, При хранении колонии становятся мукоидными, Хорошо растет на МПА и в МПБ рН 7,2-7,5, На агаризованной синтетической лизинсодержащей среде после 48 ч инкубации размер колоний достигает 1-2 мм, Форма и цвет аналогичны. При культивировании в жидкой синтетической лиэинсодержащей среде выделение пиовердина происходит нерегулярно и зависит видимо от качества дистиллированной воды, Показано, что присутствие ионов железа стимулирует образование пиовердина. Температура вышео30 С подавляет рост культуры на синтетической среде.Культура поддерживается на МПА. Оптимальная температура роста 24- 26 С. При культивировании МПБ лизин- -2-монооксигеназной активности не наблюдается, Она проявляется только при культивировании микроорганизма на синтетической лизин-содержащей среде.Внутриклеточная ЛМО проявляет максимальную активность к 45-55 ч роста культуры на жидкой синтетической среде на поступательной качалке (100 качаний в минуту)Лизин-монооксигеназную активность определяют амперометрически по убыли концентрации кислорода в ячейке с перемешиванием объемом 5 ил. Реакционная смесь содержит 0,05 М калий-фосфатный буфер рН 8,0 и 0,02 М лизин. Реакция инициируется добавлением 0,07 мл бесклеточного экстракта,П р и м е р 1, Культивирование продуцента лизин-монооксигеназы - штамма Ряецс 1 ощопая рцгЫа ВКМ В/В/ проводят на поступательной качалке (100 качаний в минуту) при 25 С в конических колбах объемом вол, содержащих по 200 мл синтетической среды следующего состава, 7.: 1.-лизин 0,3; КПРО+ ЗНО 0,15; КН РО 0,05; МяБГ 7 НО 0,02 (в дальнейшем синтетическая лизинсодержащая среда), Посевным материалом служит культура микроорганизмов, выращенных на поверхности скошенного мясопептонного агара, в течение 36 ч, Одной пробиркой со скошенным агаром засевают одну ферментационную колбу. Длительность7 4этом активность ЛМО 30,1 Е/г биомасет существенно удешевить стоимостьростовой среды, а следовательно ифермента,Формула изобретения Штамм Рэецйошопая рцСйа ВКМ В(Всесоюзная Коллекция микроорганизмов ИБФМ АН СССР, коллекционный номер ВКМ ВД) - продуцент лизин-монооксигеназы. Составитель И.ПриваловаТехред М.Ходанич Корректор С.Шекмар Редактор И,Сегляник Заказ 1868/26 Тираж 500 Подписное ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж, Раушская наб д, 4/5Производственно-полиграфическое предприятие, г, Ужгород, ул. Проектная, 4 3 131042 культивирования 55 ч, В процессе культивирования рН не поддерживают, После 55 ч роста культуральную жидкость центрифугируют, клетки промывают 0,05 М калий-фосфатным буфером рН 8,0 5 вновь ресуспендируют в том же буфере, разрушают с помощью ультразвукового деэинтегратора УДЗНи центрифугируют. В термостатируемую ячейку объемом 5 мл, содержащую 20 мМ раствор 10 Ь-лизина в калий-фосфатном буфере рН 8,0 вводят 70 мкл грубого клеточного экстракта и измеряют скорость потребления кислорода мембранным кислородным электродом в течение 1 мин, 15 после чего рассчитывают активность фермента. За единицу активности ЛМО принимают то ее количество, которое расходует 1 микромоль кислорода в минуту. Полученная таким образом активность составляет 29,8 Е/г биомассы,П р и м е р 2, Культивирование продуцента проводят так же, как в примере 1,.но посевным материалом служит культура возрастом 60 ч, выращенная на синтетической агаризованной лизинсодержащей среде.Длительность культивирования 45 ч, после чего клетки обрабатываются так же, как в примере 1, Полученная при 30сы.П р и и е р 3, Условия культивирования продуцента повторяют условия примера 2, но для удешевления среды используют в качестве источника углерода и азота в синтетической среде технический лизин с содержанием основного вещества 863, Активность ЛМО 30,1 Е/г биомассы. Таким образом, предлагаемый штамм Рзецйошопаэ рцЫа В/В/ обеспечивает повышение активности целевого продукта с 19,8 до 30,1 Е/г биомассы по сравнению с известным, В процентном отношении это означает увеличение активности на 513. Использование технического лизина позволя