Способ получения изолированных клеток печени

ОП ИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ Союз СоветскихСоциалистическихРеспублик К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ(22) Заявлено 010880 (21) 2969614/28-13 51 М. КП.З С 12 М 9/00 с присоединением заявки Нов(23) Приоритет Государственный комитет СССР ио делам изобретений и открытий.093.3(088.8) Дата опубликования описания 230882,Гринчишин, Л.А.Осипова и М,П.Вина роблем онкологии им.Р.Е.КН Украинской ССР 71) Заявитель сти 4) СПОСОБ ПО 1 УЧЕНИЯ ИЗОЛИРОВАННЫХ КЛЕТОК ПЕЧЕНИ,025-0,050,05-0,15 о ое ечение т яют в крывают бр капитирова ижнюю полую ения правой ают дисталь нижнюю полу е в предсер виную и ной крывену почечнее лию вену дне. В Изобретение относится к эксперим тальной медицине.Известен способ получения изолированных клеток печени путем промывания печени через кровеносную систему органа промывным раствором с последующим извлечением печени, пер фузированием ее солевым раствором с добавлением кдллагеназы, дезагрегацией, инкубированием и отделением полученных клеток 11 .Однако при известной способе выход жизнеспособных клеток невысок и составляет 75-90.Целью изобретения является повышение выхода жизнеспособных клеЦель достигается тем, что согласно способу получения изолированных клеток печени путем промывания печени через кровеносную систему органа промывным раствором с последующим изв" лечением печени, перфузированием ее ,солевым раствором с добавлением кол-. лагеназы дезагрегацией,инкубировани ем и отделением полученных клеток,отличительной особенностью является то, что промывание печени проводят оксигенированным раствором, содержащим вес.В: 30 Хлористый нЛимоннокиГепаринГлюкозуДистиллированнуюводув течение 20-30 мираствора 16-18 оС,генированным растввес.В:Хлористый натриХлористый калийфосфорнокислыйлий однозамещенфосфорнокислыйрий двузамещенпХлористый кальциКоллагеназуГлюкозуДистиллированнуюводуинкубирование осуще20-30 мин при 37 оСП р и м е р, Всгрудную полости десы. Перевязывают нвыше места ответвлной вены и перерезгатуры. Надсекаютв месте впадения е952958 Коллагеназа 0,035Глюкоз а 0,1Дистиллированная вода ОстальноеПерфузионный раствор также насы 5щают кислородом и поддерживают рН впределах 7,35-7,60 с помощью 10-ного бикарбоната натрия. Перфузию проводят со скоростью 6 мл/мин при37 фС в течение 20 мин,После прекращения перфузии дают1( стечь избытку раствора из органа,взвешивают 5-6 г ткани, надрезаютв .нескольких местах капсулу, помещают в стакан с 40 мл раствора, использовавшегося при перфузии, и ин 15 кубируют в термостате при 37 С и постоянном помешивании. Через 15 минклетки, перешедшие в суспензию, фильтруют через слой батиста, к остаткуткани добавляют оставшиеся 35 мп пер 2( фузионного раствора, вторично инкубируют 10 мин, и вновь фильтруют. Вобъединенном фильтрате - первичнойклеточной суспензии - определяют количество клеток и процентное содержание неповрежденных гепатоцитов,например цитологическими методами стрипановым синим.В таблице представлены данные повыходу жизнеспособных гепатоцитовпри суспенжировании печени крысы предлагаемым способом. Количество клеток, млн. Вескрысы, г Из 1 г печени Из органа 37,3 + 1,55 270,915,3 91 + 0,6 115-155 50,0 + 1,02 434,0.19,7 951,1 185-200 Выход клеток при использовании предлагаемого способа составляет 225,5 млн. в пересчете на 100 г массы тела крысы, из которых живых 214,2 млн (95), тогда как известным способом можно получить только 111,4 млн. (82,5) живых при общем количестве 135 млн. клеток, т.е, в 1,9 раза меньше. При этом воспроизводимость предлагаемого способа зна-. 55 чительно вьпае по сравнению с известным, т.е. выход клеток при применении предлагаемого способа варьирует в пределах + 1,1, а известном -Ф 7,5. 60 Формула изобретения просвет сосуда вводят притупленную инъекционную иглу соответствующего диаметра и с помощью перистальтического насоса проводят промывку печени раствором, содержащим, вес,Ъ:Хлористый натрий 0,84 Лимоннокислый натрий 0,96 Гепарин 0,7 10 Глюкоза 0,1 Дистиллированная вода Остальное перерезают сосуды портальной триады, после чего фиксируют лигатурой иглу и освобождают печень от связок. Промывку осуществляют со скоростью 6 мл/мин при температуре 16-18 С. Количество раствора берут примерно равным массе животного. Раствор за 20-30 мин, до промывки и в процессе промывки насыщают кислородом. По окончании этой операции печень переносят на воронку с ситечком из нержавеющей стали и рециркуляторно перфузируют 75 мл раствора, содержащего вес.Ъ:Хлористый натрий 0,8 Хлористый калий 0,04 Фосфорнокислый калий 0,006 Фосфорнокислый натрий 0,016 Хлористый кальций 0,07 Способ получения изолированныхклеток печени путем промывания пеКоличество неповрежденных гепатоцитов(вот общего количестваклеток) чени через кровеносную систему органа промывным раствором с последующим извлечением печени перфуэированием ее солевым раствором с добавлением коллагеназы, дезагрегацией, инкубированием и отделением полученных клеток, о т л и ч а ющ и й с я тем, что, с целью повышения выхода железоспособных клеток, промывание печени проводят оксигенированным раствором, содержащим, вес.Ъ:Хлористый натрий0,83-0,85 Лимоннокислый натрийГепаринГлюкозуДистиллированнуюводу Остальное в течение 20-30 мин при температуре раствора 16-18 С, перфузируют оксигеРедактор Г.Волкова Заказ 6215/43 Тираж 505 Подписное ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж, Раушская наб., д.4/5Филиал ППП "Патент", г.ужгород, ул.Проектная,4 нированным раствором, вес.Ъ:Хлористый натрийХлористый калийФосфорнокислыйкалий однозамещенныйФосфорнокислыйнатрий двузамещенныйХлористый кальцийКоллагеназу Глюкозу 0,05-0,15Дистиллированнуюводу Остальноеинкубирование осуществляют в течение 20-30 мин при 37 С.Источники информации,принятые во внимание при экспертизе1. и ч 1 сго, КоЬегс 1. ВоппеупА 6 ц 1 йчег рагепсйува 1 се 11 ь 1 п ргвагу сцсигеспасассег 1 ьйсь ап 6се 11 гесодпйопр, 1974, 10, М 1-2,р.р.130-142. Составитель С.Малютина Техред М,Тепер Корректор В.Бутяга