Штамм, используемый для тестирования мутагенных агентов

СОЮЗ СОВЕТСНИХцЮлаПНЮЕРЕСПУБЛИК 8012 ОПИС ИЗОБРЕТЕН ЛЬСТ 1 П 1 М в МУТАЕ 1 Д.А ТУРН 1 ТЕСТИРОВАН цгадаНаучнозпидеми .Ф.Га- тирования е 11 а урЬппорганизмово институт огни с ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССРПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ(71) Научно-исследовательский орденаТрудового Красного Знамени институтэпидемиологии и микробиологииим. почетного академика Н.Ф,Гамалеи(54) ШТАММ ЯА 1.МОИ ИСПОЛЬЗУЕМЫЙ ДЛЯ ГЕННЫХ АГЕНТОВ. (5.7) Штамм Яа 1 аоп В 59.(Музей микро исследовательског ологии и микробно малеи, используе .мутагенных агент12Изобретение относится к областимикробиологии, в частности, к генетике микроорганизмов, и может бытьиспользовано для отбора мутагенныхагентов.Целью изобретения является создание нового штамма, позволяющего в отсутствие Н-плаэмид эффективно выяв"лять мутагенные агенты, индуцирующиемутации различного родз,:возникающиев результате эамены пар основанийи/или сдвига рамки считывания.Ба 1 тпопе 11 а сурЫшцгз.цш штамм АС262 (9 59) получен на основе штаммаЭймса ТА 1535,Штамм АС 262 получен в результатемобилизации с помощью плаэмиды Н 1 йгй16 фрагмента хромосомы Е.со 11, содержащего цшц С -ген,В геном этого штамма в результатеобработки УСКвведена мутацияв аргининовый ген, возникшая вследствие сдвига рамки считывания. Агд-мутация картирована на 88 мин,генетической карты сальмонелл.Штамм Ба 1 шопе 11 а сурпшцг 1 цш хранится в Музее микроорганизмов НИИЭМим. Н.Ф,Гамалеи в лиофилизированномвиде под номером 59 и характеризуетсяследующими признаками.Морфологические признаки.Клетки палочковиднай формы размером 2-4 х 0,5 мк, подвижные граммотрицательные.Культуральные свойства,Ауксотроф: зависит от гистидинаи аргинина. Не утилизирует лактоэу.На минимальной синтетической среде А с добавками гистидина и аргинина (по 30 мкг/мл) и глюкозы (0,47)через 48 ч роста при 37 С образуетколонии, имеющие диаметр 1,5-2 ммс ровными краями.На Ь-агаре через 24 ч роста даетмелкие блестящие колонии до 2 ммв диаметре.В Ь-бульоне растет в виде равномерного помутнения.На питательном агаре Дифко через 24 ч роста при 37 С образуеточень мелкие (до 0,5 мм) колониис гладкой поверхностью.Генетическая характеристика.Штамм У 59 представляет собой гибрид, образовавшийся в результате рекомбинации фрагментов хромосомы Е.со+ .1, несущих гены гр , цшцС, яа 1Ьдо , с хромосомой Я,гурЬдшцт 1 цш.;Штамм АС 262 сохранил ряд существен 61953 2ных для его использования мутацийисходного штамма ТА 1535; мутацию поэксцизионной репарации - цчг В, мутацию, изменяющую проницаемость клеточ 5ной стенки, - гГа, мутацию Ь 1 зС 46,возникшую в результате замены пар оснований. Новая мутация в агя-генев штамме 11 59 является мутацией сдвига рамки считывания, Штамм АС 262 не1 бнесет, маркера канамицинреэистентности, свойственного плазмиде, использованной для получения гибрида. Фонспонтанных реверсий к гистидиннеэави 7симости 2-6/10, к аргининнезависи 15мости 1-3/10П р и м е р 1. Мутагенное действие 4 нитрохинолин-оксида 4(НХО),Бактерии испытуемых штаммов выращивают в Ь-бульоне в течение 18 чпри 37 С. Через 18 ч культуры разво дят в 1 О раз свежим Ь-бульоном и выращивают на качалке при 37 С до логарифмической Фазы роста. Затем культуры отмывают Физиологическим раствором с помощью.центрифугирования, ресуспендируют в фосфатном буфере (рН 7)и добавляют мутаген. После инкубациив течение 60 мин при 37 С культурыотмывают от мутагена центрифугированием, ресуспендируют в физиологическом растворе и высевают без разведения на среду, селективную для Ьз+мутагенов, возникших в результате замены пар оснований. Для учета выживших соответствующие разведения культур высевают на минимальную среду,содержащую полные добавки аминокислот. Рабочий раствор 4 НХО готовятв этаноле и хранят при +4 С. Учетрезультатов производят через 48 ч инкубации при 37 С.Расчет частоты мутагенеза произа - Ьводят по формуле М = 1 , где М - частота индуцированных мутаций; а -среднее количество мутантов на чашке при данной дозе; Ь - среднее количество мутантов на чашке в необработанной пробе; Й - среднее число клеток, выживших при данной дозе мута 50 гена.Для сравнения полученных результатов во всех опытах наряду с предлагаемым штаммом берут известные штаммы системы Эймса,55 4 НХО - сильнейший канцероген,требующий для проявления мутагенногодействия индукции БОЯ-системы репарации ДНК, вызывает почти равно выраСоставитель Г.СмирноваРедактор Н.Егорова Техред Л.Сердюкова Корректор О.Луговая Заказ 5299/20 Тираж 490 Подписное ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий 113035, Москва, ЖРаушская наб., д. 4/5Производственно-полиграфическое предприятие, г,Ужгород, ул.Проектная, 4 3 126 женный мутагенез (замена пар оснований) на сконструированном штамме 59 и содержащем К-плазмиду штамме ТА 100 и не вызывает мутагенез у бесплазмидного штамма ТА 1535. 5П р и м е р 2, Мутагенное действие этилметансульфоната (ЭМС),Определение влияния ЭМС проводят, как описано в примере 1. ЭМС-агент; не требующий для проявления мутаген О ного действия индукции БОЯ-системы репарации ДНК, оказывает почти равно выраженный мутагенный эффект относительно всех 3 испытуемых штаммов.П р и ю е р 3. Иутагенное действие 15 диаминодиоксиодигидродиазопирена (ДЫМ) .Определение влияния ДИАМ проводят, как описано в примере 1. Селективная среда для Агд+ -мутантов содержит 20 30 мкг/мл гистидина и 0,7 мкг/мл аргинина. 1953 4Мутагенная активность ДИАМ-соединения, индуцирующего мутации сдвига рамки считывания, которые в подавляющем большинстве случаев не требуют активности гена щпц С , равно выраФжены для всех 3 испытуемых штаммов до дозы 10 мкг/мл. При более высоких дозах штамм 59 дает более выраженный мутагенез.Однако выявление мутаций сдвига рамки считывания при использовании штаммов системы Эймса требует применения других, нежели в первых двух примерах, штаммов.С аналогичными результатами были испытаны еще 5 различных агентов, относящихся к различным классам соединений: УФ-свет (как в примере 1) метилметансульфонат (ММС) и Н-меткп- Н-нитро-Ю-нитрозогуанидин (НГ), как в примере 2, УСК, 9-аминоакридин (9 АА), как в примере 3.