Способ определения жизнеспособности тканей

(5)4 А 01 В 1 АНИЕ ИЗОБРЕТЕН ТОРСКОМУ У ДАРСтаЕННЫй КОМИТЕТ СССРЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ(7) Институт проблем криобиологиии криомедицины АН УССР(56) Гулевский А.К., Чуйко В.А.,Калько А.И. Биосинтез суммарныхбелков в срезах щитовидной железыпри замораживании (-196 С ) - оттаивнии 1,+37 С ), - В сб. "Актуальныевопросы криобиологии и криомедициныКиев, "Наукова думка", 1974,с.45-47 8011725(54) (57) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ЖИЗНЕСПОСОБНОСТИ ТКАНЕЙ путем инкубации ткани в присутствии Кребс-Рингербуфера, глюкозы и смеси РфС 1 аминокислот, выделения суммарных белков и измерения включения в нихфС аминокислот, о т л и ч а ю. щ и й с я тем, что, с целью повышения точности определения, проводят параллельно инкубацню ткани в среде, содержащей дополнительно инсулин в концентрации 10 -1 ОИ, а о жизнеспособности тканей судят по разности между включениемСаминокислот в присутствии инсулина и без него, щ причем жизнеспособность-ткани пропорциональна степени сохранения величины этой разности. С:Йэобретение относится к медицинеи биологии и может быть использовано при определении жизнеспособноститканей, предназначенных для консервирования и трансплантации. 5Целью изобретения является повышение точности определения жизнеспособности тканей.П р и м е р (таблица ), Срезынезамороженной щитовидной железывесом 25 г, хранившейся 60 мин,поместили в 1 мл инкубационной среды,состоящей из Кребс-Рингер-бикарбонатного буфера, 0,005 г глюкозы и1 мк Кюри смеси фС - аминокислот, 15инкубировали в течение 60 мин при37 С в атмосфере 95% С и 5% СО .Параллельно проводили инкубацию другого образца ткани, но при этомв состав среды инкубации дополнительно ввели инсулин в концентрации5 10 И, После окончания инкубации реакцию останавливали помещениемобразцов на ледяную баню, Затем добавляли равный объем 20%-ной трихлоруксусной кислоты. Полученную суспензию нанесли на фильтры Сынпор"( диаметр 0,4-0,6 мм ). Осадки триждыпромыли 8 мл охлажденной трихлоруксусной кислоты, смесью спиртхлороформ (1:1), 70 и 96 этиловымспиртом. Фильтры высушили на воздухе,поместили в 10 мл толуольного сцинтил-лятора и просчитали .х радиоактивность на счетчике 3 Ь -100 (Франция ).Радиоактивность пробы (контрольная,неэамороженная щитовидная железа )составила 591,33 ф 82,69 имп./мин/млбелка,Радиоактивность пробы с добавлени-,ем инсулина составляла 1558,0 1Ь 59,95 имп./мин/мл ткани. Разницамежду этими показателями составляла956,67 имп./мин./мп белка.В аналогичных условиях определялирадиоактивность щитовидной железы,замороженной со скоростью 100 ф/минбез криопротектора до -196 С. Радиоактивность образцов щитовидной железы, жизнеспособность которых оценивали известным способом, составила292,0 ф 28,0 имп./мин/мл белка. Есливыразить эту величину в процентахпо отношению к контролю (таблица,2)который составляет 591,33 ф 82,69имп./мин/мл белка,то она составит 507,.Параллельное исследование радиоактивности образца, которое производили после добавления в среду инкубации инсулина, показало, что даннаявеличина составляет 287 ф 57,5 имп./мин/мл белка, Поскольку разница показателей, полученных с помощьюпредлагаемого способа и известного,равнялась О, то отношение величины,составляющей эту разницу, к контролю( таблица ) также равняется О. Следовательно, согласно предлагаемомуспособу оценки жизнеспособности, данный показатель для щитовидной железы, замороженный до -196 С безприменения криопротектора, составляетО.Дополнительный анализ микроскопического строения аллогенных трансплантантов щитовидной железы, изъятых на 20-е сутки после пересадки,выявил только в 2-х образцах из 10(207) сохранение на периферии участков фолликулярных клеток. В остальных случах фолликулярная структуратиреоидных трансплантантовне сохранилась и наблюдалось ее замещение соединительно-тканевыми элементами.Щитовидную железу замораживалисо скоростью 6,5 /мин до -196 Св присутствии 12,57. ДМСО (Таблица, 3).Анализ жизнеспособности этих образцов щитовидной железы, проведеннойизвестным способом, показал, чтоуказанный показатель составляет 50%.В аналогичных условиях производилиопределение жизнеспособности щитовидной железы предлагаемым способом.Согласно полученным данным жизнеспособность составляла 20,27.Анализ микроскопического строенияаллогенных трансплантантов щитовидной железы, консервированных указанным ввпве способом показал, что в3-х образцах из 10 Сохранилось значительное количество участков фолликулярных клеток.Определяли жизнеспособность щитовидной железы, консервированной с12,57. ДМСО со скоростью 1 /мин до-196 ОС (Таблица, 4 ). Жизнеспособность консервированной ткани,оцененной известным способом, составляла 107%, а предлагаемым 70,47.Проведенное изучение морфологического строения трансплантантовщитОвидной железы, консервированныхуказанным выше способом, позволилоустановить сохранение в 7 случаях17251 способом 3из 1 О фолликулярного строения транс- плантантов.Таким образом, данные о жизнеспособности криоконсервированной щитовидной железы, полученные известным способом, только в одном из 3-х случаев (таблица, 4приблизительно совпадали с результатамиэ полученными при изучении микроскопического строения трансплантантов а данные, полученные предлагаемым чаев.Приведенные примеры показыйают, что предлагаемый способ позволяет с более высокой точностью определять жизнеспособность ткани, поскольку он предусматривает определение не только степени сохранения функциональной активности ткани, но и оценку ее способности к репарации структурно-функциональных повреждений. 1 О Сравнительная опенка хиэнеспособиостиконсервированной щитовидной хелеэы, проведенная известным способом н предлагаемым Предлагаемый способ: включение мс-аминокислот в суммарные белки под влиянием инсулина,нмп./мип/мг беля Жизне азниИзвестный способ:Включение С- аминокислот в суммарные белки, имп./мин/мг белка Условияэксперимента спо- соба меху покаател ими определяемаяпредпагаемымспосо Щито ная неле"эаконтроль591, 3382,6 58 01159,6,67 Фолликулярноестроениесохраняетсв 1 обраэциэ 10 (ОХ 2,0128,0 7,5 ф 57,5 Фолликулярное строение сохраняется в 3-хслучаях из10 (302 СО до бвС 299,64158,193,69 20 93,3351,6 4 Замораннвание 1 ф/минс 12,52 ДИСО196 ФС637 67. Фолликулярное строени сохраняется в 7 случаях нз 1 О 701 ) 311,33+169,83 673,66 70 1002 2 Заморахиваине в 00/ мин до196 ФС беэ криопротектора 3 Заморахнвание с 1252 Жиэне- способность определяемая известным спо собем,2 4в трех из 3-х слузнеспобность, ределяая с позью дополт тельного особа (опделение икроскопнского роения ансплантата цитовидной хелезы