Способ гистохимического выявления аденилатциклазы в нервной ткани

(5 т С 01 И 1/28 А 61 В 10/00 ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССРПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ", 3Н АВТОРСКОМУ( СВИДЕТЕЛЬСТВУ(72) О.В. Копьев и С,А, Ромоданов (71) Киевский научно-исспедовательекий институт нейрохирургии и Киевский государственный институт усовершенствования врачей(56) Гайер Г, Электронная гистохимия, М., "Мир", 1974, с. 171-172.КеЖ .1., Регго 1 й С.Ь., Н 1 ая 1 пя Б.А. Ногшопяепя 1 гче апепу 1 сус 1 аяе сусо сЬеш 1 са 1 1 оса 1 дяаг 1 оп 1 ш гаг 11 чег.- "Бе 1 епсе", 1970, 168, 382-384.(54) (57) спосоБ ГистохимическогоВЬИВЛЕНИЯ АДЕНИЛАТЦИКЛАЗЫ В НЕРВНОЙТКАНИ, включающий ее фиксацию и инкубацию в субстрате, содержащем АТФ,о т л и ч а ю щ и й с я тем, что,с целью повышения точности способа,перед инкубацией ткань обрабатываютв течение 1,5-2 ч в среде с ингибиторами фосфогидролаз.Изобретение относится к биологии,а именно к гистохимии, и может бытьиспользовано для определения активности аденилатциклазы.Цель изобретения - повышение точности способа.При осуществлении способа гистохимического выявления аденилатциклазыв нервной ткани биологический материал подготавливают к электронномикро 10скопическому выявлению аденилатциклазы поэтапно, причем на первом этапеинкубируют в среде без субстрата сингибиторами фосфогидролаз в течение1,5-2 ч, а на втором - инкубируют всреде с АТФ в течение 30-40 мин,Способ подготовки биологическогоматериала к гистохимическому выявлению активности аденилатциклазы с использованием АТФ в качестве субстрата 2 Оосуществляют следующим образом,Исследуемый материал подвергаютпрефиксации перфузией холодного1 Е-ного раствора глютаральдегида на0,1 М фосфатном буфере (рН 7,4) втечение 20 мин. Фосфатному буферуотдают предпочтение перед другими,так как он способствует угнетению активности Фосфогидролаз,По этой же причине избран глюта- ЗОральдегид в качестве Фиксатора. Затем материал отмывают на холоде втечение 16-18 ч в 0,1 М трис-малеатном буфере (рН 7,4) с 87 сахарозыи 1,5-2 ч в 0,1 М трис-малеатном 35буфере (рН 7,4) с 5 мМ теофиллина,10 мМ фторида натрия, 10 мМ бубаина,10 мМ парахлормеркурийбензоата, которые угнетают активность фосфодиэстеразы, циклического аденозинмонофосфата, Фосфогидролаз. Указанное вре-,мя отмывки необходимо для максимально полного удаления Фиксирующегораствора и частичного восстановления активности аденилатциклазы, Минимальное время инкубации с ингибиторами составляет 1,5-2 ч. Этоговремени достаточно для проникновения ингибиторов в наружный слой кусочка ткани и осуществления внем 5 Освоего ингибирующего действия. Какизвестно, гистохимическая реакцияциклизации АТФ, катализируемая аденилатциклазой, проходит именно вэтом наружном слое кусочка. 55После инкубации с ингйбиторамиматериал переносят в среду инкубацииследующего состава, мм: трис-малеатный буфер 80 (рН 7,4); теофиллин 2;ацетат магния 2; нитрат свинца 2;АТФ 0,5, Инкубацию проводят 30-40 минпри 37 С, после чего материал обрабатывают по общепринятой электронномикроскопической методике и заливают в эпон-аралдит.Указанная длительность инкубации (30-40 мин) минимальна и достаточна для появления хорошо идентифицируемого продукта реакции. Болеедлительная инкубация сопряжена с появлением процессов диффузии, которыезатрудняют оценку реакции.П р и м е р 1. Мозг Фиксируютперфузией холодного 17-ного раствораглютаральдегида на 0,1 М фосфатномбуфере (рН 7,4) в течение 20 мин.Затем иссекают кусочки мозга около1 мм в объеме, промывают их 2 чв 0,1 М трис-малеатном буфере нахолоде и инкубируют 30 мин при37 С в среде следующего состава,мм:трис-малеатный буфер 80 (рН 7,4)1ацетат магния 2; ацетат свинца 2;АТФ 0,5.Продукт .реакции : в виде обильного грубого преципитата локализован на конденсированном хроматинеядер, плазматических мембранах,эндоплазматическом ретикулуме, чтоне характерно для аденилатциклазыи характерно для фосфогидролазнойактивности. На результате реакциине отражается введение в инкубационную среду ингибитора аденилатциклазы аллоксана.П р и м е р 2, Головной мозгфиксируют перфузией холодного1 Ж-ного раствора глютаральдегидана 0,1 М фосфатном буфере (рН 7,4)в течение 20 мин. Затем иссекаюткусочки мозга около 1 мм в объеме,после чего проводят преинкубациюкусочков 1,5 ч на холоде в средеследующего состава: 0,1 М трисмалеатный буфер (рН 7,4) 5 мМ теофиллин, 10 мМ Ьторип натрия, 10 мМ бубаина, 10 мМ парахлормеркурий бензонат, Затем проводят инкубацию30 мин при 37 С в среде следующегосостава, мм: трис-малеатный буфер 80(рН 7,4); ацетат магния 2; свинец 2;АТФ 95,Продукт реакции локализуется в виде тонкого преципитата на постсинаптических окончаниях и на плазматических мембранах. Неспецифического1168819 Составитель В. ЧистяковТехред С,Мигунова Корректор М. Розман Редактор О. Бугир Заказ 4607/36 Тираж 897ВНИИПИ Государственного. комитета СССРпо делам изобретений и открытий113035, Москва, Ж, Раушская наб., д, 4/5 Подписное Филиал ППП "Патент", г. Ужгород, ул. Проектная, 4 отложения продукта реакции не наблюдается. Аллоксаном реакция предотвращается, что свидетельствует о специфичности реакции.П р и м е р 3. Всю обработку про водят аналогично примеру 2, но преинкубацию осуществляют 2 ч. Результат такой же, как в примере 2.П р и м е р 4. Всю обработку про-. водят аналогично примеру 2, но переинкубация длится 2,5 ч.Количество продукта реакции значительно уменьшено по сравнению с примером 2, кроме того, появилось неспецифическое выпадение продукта реакции,15 не связанное с мембранными структурамиеП р и м е р 5 Вся обработка аналогична примеру 2, но преинкубацию проводят 1 ч. 20Распределение продукта реакции характерно для фосфогидролазной активности и не изменяется при введениив инкубационную среду ингибитора аденипатциклазы аллоксана. П р и м е р 6. Мозг фиксируют и отмывают аналогично примеру 1. Затем без преинкубации с ингибиторами кусочки инкубируют в среде следующего состава, мм: трис-малеатный буфер 80 (рН 7,4); теофиллин 2; ацетат магния 1, ацетат свинца 2; аденилилимидодифосфат 0,5.Продукт реакции в виде тонкого преципитата маркирует активность аденилатциклазы в плазматических мембранах и на постсинаптических окончаниях, но наряду с этим грубый преципитат выявляется на других клеточных структурах и в ударах клеток, что обусловлено гидролизом эндогенного субстрата, активностью фосфогидролаз,