Способ определения активности множественных форм щелочной фосфатазы

(9) О 1) 4(5)С 01 И 33/48 САНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ В ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССРПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЫТИЙ МУ СВИДЕТЕЛЬСТВ(56) 1. Ооппе У., Реппе 11 у У. Ис,Сцпеу К. Сапсег, 1967, Ч.20, р.71 (прототип),(54) (57) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АКТИВНОСТИ МНОЖЕСТВЕННЫХ ФОРМ ЩЕЛОЧНОЙфОСФАТАЗЫ путем гель-фильтрации втонком слое, извлечения полученныхфракций, проведения ферментативнойреакции с и -ннтрофенилфосфатом в качестве субстрата с последующей спектрофотометрией продукта, о т л и -ч а ю щ и й с я тем, что, с цельюповышения чувствительности способаизвлечение продукта фермент-субстратной реакции проводят 0,05-1,0 н.ИаОНИзобретение относится к биохимии и может быть использовано для диагностики обтурационных желтух, а также количественного определения форм щелочной Фосфатазы, отличающихся молекулярной массой высокомолекулярных комплексов и свободных молекул, находящихся в смеси.Известен способ определения актуности множественных Форм щелочной фосфатазы путем гель-фильтрации через колонку с сефадексом Гс последующим определением активности в большом количестве фракций 11 .Однако известный способ дает возможность анализировать только один образец, требует большой затраты времени и материала (0,5-1,0 мл сыворотки) и не позволяет проводить серийных исследований.20Цель изобретения - повышение чувствительности способа.Указанная цель достигается тем, что согласно способу определения активности множественных форм щелочной фосфатазы, путем гель-фильтрации в тонком слое, извлечения полученных фракций, проведения ферментативной реакции с и-нитрофенилфосфатом в качестве субстрата с последующей спек 30 трофотометрией продукта, извлечение продукта Фермент-субстратной реакции проводят 0,05-,0 н, ИаОН.Способ осуществляют следующим образом.Разделение сывороток или другого исследуемого материала проводится в приборе для тонкослойной гель-фильтрации на стеклянной пластинке 5 х 23. см в 0,5 мм слое сефадекса Гсверхтонкого, уравновешенного 0,025 И трис-НСГ буфером рН 8,0, содержащим 0 15 И МаС,. Угол наклона пластинки 20 . Сыворотки наносят в количестве 0,01-0,02 ми. Разделение продолжается 5-6 ч. 45Активность полученных фракций определяют с помощью бумажных реплик (ватман У 3) Зх 15 см, пропитанных субстратной смесью следующего состава: 0,25 М карбонат-бикарбонатный буфер рН 10,1 1 О мм п-нитрофенилфосфата, 5 мм МяС 1, которая равномерно в количестве 1 мл наносится пипеткой на бумажные реплики, помещенные в кювету из оргстекла. Лен,.,о ты просушивают в темноте при 7 С и хранят в темноте при комнатной температуре до использования и используют в день приготовления. Эти реплики накладывают на участок пластинки, содержащий разделенные фракции каждой сыворотки, и снимают через 3 мин. Затем их помещают в герметическую кювету из оргстекла и ино кубируют в темноте 30 мин при 37 С. В результате этого репликах выявляются фракции щелочной фосфатазы в виде ярко-желтых пятен, Дпя количественного определения активности фракций реплики разрезают на части, содержащие окрашенные зоны, и немедленно помещают в пробирки, в которые предварительно вносят 4 мл 0,05- 1,0 н, раствора 11 аОН. Образовавшийся в результате реакции и-нитрофенол элюируют О мин при комнатной температуре и измеряют экстинкцию раствора при 410 нм против 0,1 н. ЫаОН соответствующей концентрации. Аналогичной обработке подвергают контрольную реплику, которую накладывают на часть пластинки, не содержащую сыворотки. После окончанйя эиюции измеряют длину бумажных отрезков.Для,расчета активности во фракциях из величины экстинкции элюата фракции вычитают экстинкцию элюата контроля, по площади соответствующую определяемой Фракции, Величина экстинкции элюата пропорциональна активности фермента.Приме р 1, Больная Ш. 59 лет, диагноз - хронический гепатитОбщая активность щелочной Фосфатазы определяли методом Бессей, Лоури и Брок и она была равна 81,8 мм/л чРазделение сыворотки вели описанным способом, Элюцию вели 0,1 н ИаОН.,В результате было установлено, что процентное содержание щелочной Фосфатазы в первой фракции составляет 31,6-31,8 Е, что соответствует активности 25,8-26,0 мм/л ч, а во второй фракции - 55,8-56,0 мм/ /л ч.П р и м е р 2. Больной Ж. 42 лет диагноз - вирусный гепатит, Общая активность щелочной фосфатазы 10,9 мм/л ч. Определения ведут как в примереЭлюцию проводят О,05 н. 11 аОН. В результате исследования было установлено, что процентное содержание Фермента в первой фракции было 14,9 с активностью 1,62 мм/л ч, а во второй 85,17. с активностью 9,8 мм/л ч,1153294 Составитель И.ЕмельяненкоТехред Л,Микеш Корреютор И.Эрдейи Редактор М.Келемеш Заказ 2500/38 Тираж 897 Подписное ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж, Раушская наб., д. 4/5Филиал ППП "Патент", г. Ужгород, ул. Проектная, 4 3П р и м е р 3. Больная Я. 27 летдиагноз - вирусный гепатит. Общаяактивность щелочной фосфатазы2,6 мм/л чОпределение щелочной фосфатазы проводили по примеру 1, элюцию производили в 1 н,ИаОН. В результате исследования установлено, что процентное содержание щелочной фосфатазы в первой фракции составило 29,9 с активностью 3,78 мм/луч, а во второй - 70,17,с активностью8,82 мм/л.ч.Изобретение повышает производительность способа в 50 раз по сравнению с прототипом, за счет чегосокращается объем исследуемой сыворотки с 0,5-1 мп до 0,01-0,02 мп.Способ прост в исполнении и сокращает время анализа в связи с тем, 1 О что определения активности ферментеведут в 2-3 фракциях вместо 30-40по известному техническому решению.