Способ выделения биологически активной фракции из семенной жидкости животных

ОПИСАНИЕИЗОБРЕТЕНИЯК АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ Саноз Советских Социалистических Республин(5) М Кл А 61 К 35/ заявкис присоединение (23) ПриоритетГосударственный комитеСовета Министров СССРпо делам изобретенийи открытий 53) УДК(611. 013.(45) Дата опубл 05,0978, Бюллетеньвания описания 20077 В.А,Миронов,В.А.Панкратов,С.П.Попов,О.Н.Владимиров,А.С.Макеев, А.А.Нещадин,Л.В.Миронов и А.А.Ариас Авторыизобретеии Московский технологический институт мя промышленности и Московский ордена Октмясокомбинат ой и молочнойрьской Револю Заявители 4) СПОСОБ ВЫДЕЛЕНИЯ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНОЙ ФРАКЦИ ИЗ СЕМЕННОЙ ЖИДКОСТИ ЖИВОТНЫХ ано Вод ции ами ПГ тр глощением ри длител ии щелочи Изобретение относится к способам выделенйя биологически активных биогенных веществ, в частности к извлечению биологически активной фракции семенной жидкости животных. указанная 6 фракция может найти применение в животноводстве,например,для синхронизации половой охоты домашних животных.Известен способ выделения фракции простогландинов (ПГ) из предста тельной железы баранов 1) .По этому способу ПГ выделяют из замороженных предстательных желез баранов путем многократной экстракции эфиром, многоступенчатого про- .И тивообмена между эфирной и буферной фазами и хроматографического разделения с промежуточным вакуумным упариванием экстрактов.Недостатком указанного способа. ф извлечения биологически активных фракций является его сложность и наличие большого числа технологических операций, что не позволяет использовать его в крупном, масштабе. 25Цель изобретения - упрощение сйособа без снижения биологической ак- тивности получаемой фракции,Это достигается тем, что перед экстракцией к семенной жидкости добавляютэтанол, декантируют водно- спиртовую смесь и подвергают ее обработке гидроокисью кальция, полученный осадок регенерируют кислотой при одновременном добавлении к нему эфира для проведения активной фракции.Предлагаемый способ осуществляют следующим образом.Семенную жидкость заливают эт лом, перемешивают и отстаивают. но-спиртовую смесь после деканта и промывки концентрируют вакуумным упариванием приокомнатной температуре. Упаренный раствор обрабатывают гидроокисью кальция и отделяют осадок от раствора. Сухой осадок регенерируют соляной кислотой с одновременной экстракцией эфиром. Эфирный раствор жирных кислот после отделения и высушивания упаривают. в вакууме и последовательно подвергают фракционному разделению в хроматографической колонке, Отбор фракций на колонки ведут элюэнтом, содержащим бензолФтилацетат-метанол в разных соотношениях.Известно, что с уппЕиГ обладают слабым по в Уфспектре. Однако и ьном нагревании. и .присутств они изомеризуюгся в ПГ типа В, молекула которых содержит сопряженные Сф 0 и С=Ссвязи, что обуславливаетпоявлениемаксимума поглощения в УФ-спектре.При поглощении ПГЕв УФ-спектресоответствует 278 нм.Испытание биологической активности получаемых Фракций проводят наизолированном отрезке гладкомышечной ткани,При сравнении способов извлечениябиологически активных Фракций изсеменной жидкости животных по известному и предлагаемому способу видно,что последний является более простым,так как исключает многократную экстракцию эфиром и многоступенчатоераспределение между эфиром и буфферным раствором, а также существенноснижает расход реагентов,Одновременно сохраняется биологическая активность получаемных фракцийПГП р и м е р 1. Нанеску семеннойжидкости баранов н количестве 50 гпомещают н колбу емкостью 0,5 л смешалкой и разбанляют 150 мл 95 Ъ-ного этанола, затем перемешивают втечение 1 ч, после чего смесь отстаивают 30 мин, водно-спиртовой растворотделяют декантацией, Остаток промывают при перемешинании 150 мл 95%ного этанола н течение 30 мин ицентрифугируют. Обьединенные водноспиртсные экстракты упаривают н вакууме (20 мм рт.ст., 23 С) до объема30 мл. К упаренному раствору припереме 11 инанин в течение 1 ч добавляют 15 мл 0,0125 М раствора гидроокиси кальция.Смесь разделяют на центрифуге итвердую фракцию осторожйо дваждыпромывают эфиром (по 10 мл).В колбу емкостью 250 мл с мешалкойзаливают равные (по 50 мл) объемыэфира и 0,1%-ной соляной кислоты ивносят твердый осадок кальциевых солей.Систему выдерживают при перемешивании в течение 1 ч.После расслоенияэфирный раствор отделяют, высушиваютЯ ои течение 12 ч при температуре О Снад безводным сульфатом натрия. Эфирзатем удаляют вакуумным упариванием(20 мм рт.ст., 18 С) и растворяютосадок в 50 мл смеси бензол-этилацетат-метанол в отношении объемовб:411 и пропускают раствор черезхроматографическую колонку (13 Х 5002-5 - злюаты. Из каждой Фракцииэлюата отбирйют пробу объемом 5 мл,растворитель из которой удаляютвакуумным упаринанием. Остаток пробы растворяют в 10 мл физиологического раствора. Биологическую активность фракций 1-5 определяют,кимографически по методике, разработанной на кафедре внутренних болезней-ИТИММП (снимают кимограммы изолированных отрезков тонкого отделакишечника кролика под воздействиемфизиологических растворов, содержащих выделенные фракции ПГ)5 10 Физиологической (биологической) активностью обладают фракции ПГ 3 и 4, Элюаты 3 и 4 объединяют и упаривают н вакууме при разрежении 20 мм рт.ст, и температуре 28 фС. Получают 0,0197 г твердого остатка, который растворяют в 159 мл Физиологического раствора. Указанный раствор биологически активной фракции может ,быть применен в данном виде. 15 20 30 35 40 Формула изобретения Способ выделения биологически активной фракции из семенной жидкости животных, включающийее экстракцию и последующую хроматографическую очистку и разделение, о т л и ч а ющ и й с я тем, что, с целью упрощения способа без снижения активности получаемой Фракции, перед экстракцией к семенной жидкости добавляют этанол, декантируют водно-спиртовую смесь и подвергают ее обработке гидроокисью кальция, полученный осадок регенерируюткислотой при одновременном добавлении к нему эфира Для проведения экстракции активной фракции. Источники информации, принятые бО во внимание при экспертизе: 1.У.оХ В 1 оВ Спеа,1963т. 238,910, с, 3 229-3 234. Тираж 703 Подписноег.Ужгород, ул.Проектная,4 для индентнфикации фракции пробу смесей 3 и 4 обрабатывают 0,1 н.раст" вором едкого натра и нагревают при 50 С в течение 30 мин. УФ-спектр поглощения фракции составляетЬ п, = 278 нм, что согласуется с дан- ными, опубликованными в журналеЛо 1 31 оГ.сЬеп. , 241, 92, 257, 1966,Тонкослойная хроматография (хлороформ:диоксан:вода:уксусная кислота при соотношении 35:60:2:З,проявитель- метанол); вода:серная кислота при соотношении 18:1:1, прогревание до 100 С):) и 3 равно, соответственно, О,бб и 0,55