Способ определения тромбогенных свойств сосудистых протезов

9) ) 4(5К АВТ следуемым ный и де азмой с оцитов, заомбоцитов и сосудов Т своймбоцитов в агремм исследуемого Т ислх н тромбоциа 1 мм д анного сосу в в агрега ндотелизиисло ах н ОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ СССРО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЫТИЙ ИСАНИЕ ИЗОБР ОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВ(71) Всесоюзный кардиологический научный центр АГ СССР и Центральный ордена Ленина институт усовершенствования врачей(54)(57) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ТРОГБОГЕННЫХ СВОЙСТВ СОСУДИСТЫХ ПРОТЕЗОВ путем перфузии исследуемого протеза биологической жидкостью, содержащей тромбоциты, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что, с целью повышени точности способа, одновременно с испротезом перфузируют нативдотелизированный сосуды плзаданным количеством тромбтем подсчитывают число трв агрегатах на поверхности определяют тромбогенныества, 7.:Т х 100,Т,-Т,где Т - число тротах на 1протеза; омбоцитов в агрега. мм нативного сосу 1153293Изобретение относится к медицине,в частности хирургии, ц может бытьиспользовано при отборе новых материалов длясосудистых протезов иклапанов сердца. 5Протезы из синтетических материалов, аллогецные и аутоге иые сосуды используют для пластики артерийсреднего и малого диаметра,Наиболее частым послеоперационным 10осложнением в ранний период являетсяокклюзия просвета тромба, в поздниесроки окклюзия возникает в результате гиперилазии неоинтимы и вторичного тромбообразования. Указанные 15осложнения связаны с ацгезий тромбоцитов на поверхности протеза, активацией тромбоцитов с освобохдециемтромбоцитарных факторов и формированием агрегатов. Поэтому необходимо 20определение тромбогециых показателейпротезов.Известен способ оценки тромбогецных свойств сосудистых протезов ириискусственной перфузии их геиариццзированной кровью 1 .Согласно этому способу используют две параллельные системы циркуляции (опытную и контрольную), изготовленные из силиконовой резины.В опытную систему встраивают протезы длиной 15 см. Под давлением 90120 мм рт.ст, протез и контрольнуюсистему перфузируют гепарицизировдц- .ной кровью человека в режиме рециркуо 35ляции в течение 60 .мин при 37 С,Поскольку в данном способе используют гепаринизированцую кровь, то доперфузии и несколько рдз в течениеперфуЭии контролируют кровь цд локд 40затели свертывания: фибриногец,гемоглобин, гематокрит, количествотромбоцитов, гепдрин, адгеэию и агрегацию тромбоцитов. Контрольнаясистема необходима для оценки влияния поверхности соединительных шлац 45гов на коагуляционные свойства кровив системе циркуляции. 1 ромбогенныесвойства протезов определяют поуменьшению количества тромбоцитон вперфузате через 15, 30 и 60 мин перфуэии и качественно оценивают с помощью растровой электронной микроскопии по наличию тромбоцитов (особенно агрегатов) ца поверхности протезов,Недостатком способа является отсутствие количствецных критериев тромбогецностц поверхности сосудистых имплднтдтов. Кроме того, отсутствие анализа стадий адгезии и агрегации тромбоцитов на поверхности протезов не цдет возможности сделатьдлительный поспеоперационный прогноз.Цель изобретения - повышение точности способа,Поставленная цель достигаетсятем, что иерфузируют цитратной плазмой с тромбоцитами одновременно сисследуемыми протезами нативную идеэндотелизировдцную иупочную вену,д затем с помощью растровой элекгронной микроскопии подсчитываютобщее число тромбоцитов ц числотромбоцитов в агрегатах ца поверхности образцов и определяют тромбогеццые Т свойства,Е:Т = , , - х 100ЬТ - Т2где Т - число тромбоцитов в агрегдтдх ца 1 ммисследуемого протеза;Т - число тромбоцитов в агрегдтдх на 1 мм нативцойпуиочцой вены;Т - число тромбоцитов н агре 5гдтдх на 1 ммдеэндотелизировднцой пупочной вены.Для опредепения адгезивных и тромбогенцых свойств протезов получалиперфузат, подготавливали для перфуэии цдтивную пупочцую вену, получали сегмент деэндотелизцрованной пуиочцой вецы, собирали систему иерфузии, включающую все исследуемые протезы и сегменты вен, после перфузии фиксировали образцы и из каждогобрали пробы для анализа, количественно оценивали ддгезцвцость и тромбогенность протезов.Для приготовления перфузата у донора брали 100 мл крови, смешивали сдцтикоагулянтом, состоящим из 0,65 Млимонной кислоты, 0,85 М лимоннокислого натрия и 201 декстрозы; соотношение кровь:днтикоагулянт 6:1.Кровь центрифугировали при 600 д втечение 10 мин, Голучали супернатант 1, представляющий собой плазму, богатую тромбоцитами. Осадок вторично центрифугировали при ч 000 д в течение 20 мин. Суперндтантомразводили суперндтантдо конечнойконцентрации 2 хО тромбоцитов в81 мл. Полученную илдэму с тромбоцитами использовали в качестве иерфу1153293 критической очке, вскрывают вдоль,напьняюз. оцтом слоем 30 цм.Адгезировдные тромбоциты подсчитынают с помощью сканирующего элекгронного микроскопа 3 Б Ив 50200 рандомически выбранных поляхзрения площадью 450 мкм 2 при увеличении в 4000 раз,Адгеэинность протезов 1,Л) вы-,числяют по Формуле,7.:3 ггде И - общее число тромбоцитовгна 1 мм исследуемого про 15 теза;И - число тромбоцитон ца 1 ммггнативной пупочцой вены;И - число тромбоцитов на 1 ммг3деэндотелизиронанной пу 20 почцой вены.Тромбогенность протезов (Т) вычисляют по формуле,Е:т : . - ф х оо,т,-т,где Т - число тромбоцитов в агрегатах цд 1 мм исследуемого 30 35 40 Дополнительным критерием агрегацни служило процентное содержание агрегатов по 2-5, 6-15 и более 15 45 тромбоцитов. После перфузии протезы и сегменты вец промывают 200 мл среды 199 и Фи 1 ссируют 2,5 Е-ньгм глютдроным д:ь дегидом, приготовленным на растворе Тироде, н течение 16 ч при ддвлениц 60 мм рт.ст. Затем протезы омывают от фиксатора в течение 20 мин проточной водой, дегидратируют и рдстно рдх этдцолд возрастающей концентрации (40, 60, 80, 90, 96, 100 Е) и дцеОтоне по 15 миц при 37 С, сушдт прц эдтд. Дня коцтро я ерфуэдтд ц систем ци 1 куяибрагш 2 мкл церфузатд до и посг 1 ерфузии и фиксирондли гг тчецие 2 ч н 8 мп 2,57.-огогцютдроного дльцегидд, приготошеного ца растворе Тироле (р 11 7,3).Фиксировали тромбоциты и осажд;глинд фильтры нуклеопоры, Тромбопцтыисследовали с помощью растровойэлектронной микроскопии (12).Подготозкд цатинной пупочцой ены для перфузии.Срдзу после родов пуповину промывают средой 199. В .стерильном контейнере доставляют в лабораторию ииспользуют для перфузии в течение30-60 миц. Сохранность эндотелиальцого покрова цупочцой вены контролировали с помощью растрового электроого микроскопа.Подготовка деэндотелизировацнойпупочной вены для перфузии.От натинной пупочной вены отсекают сегмент длиной 5 см. Вцутрисосудистым бдлоцным кдтетером Фогдртцдиаметром 6 мм, раздутым цод давлением 400 мм рт,ст , деэцдотелизировали пупочную вену. Полноту удаленияэндотелия контролируют с помгццьюрастровой электронной микроскопии.П р и м е р 1. Сегменты протезов,биоимплднтацт, изготовленный н 1 цституте сердечно-сосудистой хирургииим.Бакуиена, а также сегменты цдтицной и деэндотелизированцой пуцочцойвены каждый длиной 5 см и дидметром б мм последондтельно соединяютчерез кднюпи н здгмкнутую цепь и г;новременно перфузируют н режиме рециркуляции плазмой человека цри гидростатическом данлешш 60 мм рт.ст.,скорости тока 20 мл /мш, теме ратуре 37 С в течение 30 мин. Для соео,динительных шлангов использовали силиконовую резину с внутренним диаметром 5 мм, Обьем перфузатд составляет 30 гн. протеза;Т - число тромбоцитов в агрегатах на 1 мм цативной пугночной вены;Т. - число тромбоцитов н агрега 1ггах цд 1 мм деэцдотелиэиронанной пуцочцой вены.Для дополнительной характеристики адгезивных свойств протезов определяют в процентах количество одиночных тромбоцитон, имеющих форму сферы (первичная стадия контакт.ной активации) и количество распластанных тромбоцитон (вторичная стадияоцтактцой активации). В процессе перфузии происходила незначительная активация тромбоцитов н перфуэате. Об этом свидетельствует снение процентного содержания дискоидцых форм с 54 (до перфузш) до 422 (осле церфузии) и увеличение сфер с псендоподиями с 18 до ЗОБ; количество сфер и дисков с лсевдоподиями це менялось. Число тромбоцитов в перфуэдте уменьшалось с 2,0 до 1,8 х 10 мл.1153293 Агрегаты тромбоцитов Контактная актива- ТромбоПлоти ст ь Лдгезивность(А),7. Пуиочнаявена генцость(Т,Е ция адгезии ца 1 мм 2-5 6 - 15 )15 Первич- Вторичнаяная Натив 35 0 0 31 1150 0 ная Деэндотелизированцая 00 7 2839 90200 12 100 Биоимплацтат 0,4 42 14 0 1450 0,3 Составитель 3. ВальковскаяРедактор И.Кспемеш Техред Л.Микеш Корректор И.Эрдейи Заказ 2500/38 Тираж 897 ПодписноеИ 1 ИИПИ Государственного комитета СССРпо делам изобретений и открытий113035, Г 1 осква, Ж-.35, Раушская наб д. 4/5 Филиал ППП "Патент, г. Ужгород, ул, Проектная, 4 Количественные характецистики адгезивностп и тромбогенцости протезов и Приведенные данные свидетельствуют, что биоимплантат по адгезивности и тромбогенности близок к нативной пупочной венеТем це менее на биоимплантате происходит увели- ЗО чение популяции первично активированных тромбоцитов и появляются агрегаты средних размеров из 6-15 тромбоцитов, которые отсутствуют на нативной пупочной вене, 35Использование предлагаемого способа позволяет проводить количественную оценку адгезивных и тромбоцативной идеэцдотелизировлцной пупочцой веныпредставлены в таблице. генных свойств искусственных протезов по более чувствительным критериям, чем те, которые использовалисьранее. Раздельный анализ адгезивности и тромбогецности позволяетделать прогноз с ранних и позднихпослеоперационных осложнениях. Предложенный подход может быть использован дпя сравнительного отбора протезов в качестве трансплантатов, а,также для анализа эффекта препаратов,предупреждающих адгезию и агрегациютромбоцитов на поверхностях.