Способ получения комплекса еас 1, 4, 2 для количественного определения функциональной активности с 3 фракции комплемента

(2 (2 Р 22и В.Н.Потакий госудатут венный ерименцина",М.Мейер, Эксп мия. М., "Меди шенияти целспосокомплтретьйодом ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССРПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ ПИСАНИЕ 1) 3311474/282) 02.07,81(54) ( ЕАС 1 ЛЕНИЯ ФРАКЦ следо компл мента .щ и й 7) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ КОМПЛЕКСА 4,2 ДЛЯ КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕ ФУНКЦИОНАЛЬНОЙ АКТИВНОСТИ С 3 ИИ КОМПЛЕМЕНТА, включающий поательное присоединение к ЕА ксу очищенных фракций комплеС 1, С 4 иС 2, отличаюс я тем, что, с целью повычувствительности и стабильносевого продукта и упрощения а, присоединение С 2 фракции мента осуществляют с помощью го реагента Е, окисленного20 Окисление К производят смешиванием с равным объемом оптимально, разве денного стандартного раствора йода (предварительно испытывают разведение раствора иода 1/5, 1/7, 1/1 О, 1/12 в 0,09 М растворе фосфатного буфера, рН 6,0) в течение 5 мин 0 при комнатной температуре. К обрао ботанный иодом, диализуют при 4 С в те. чение ночи против 10 л вероналового буФера с рН 7,2-7,4. Диализат - охуК 5П р и м е р 2. К 5 мл охлажденной гемосистемы (ЕА) добавляют 0,25 мл цельного охуК 5 и выдерживают 15 мин 1 10972Изобретение относится к медицине,в частности к иммунохимии.Известен способ получения комплекса ЕАС 1,4,2 при помощи обработкинеразведенной сывороткой морской 5свинки сенсибилизированных эритроцитов барана в специально подобранныхусловиях температурного режима 11 3.Однако известный способ недостаточно чувствителен к С 3. 10Известен также способ получениякомплекса, включающий последовательное присоединение к ЕА очищенныхфракций комплемента С 1, С 4 и С 2,причем присоединение С 2 осуществляют в буфере, содержащем0,00015 МСа и 0,0005 М МЛри специально подобраных условиях температурного режима 2 1.Однако известный способ трудоемок, а полученный комплекс недостаточно стабилен и чувствителен к С 3.Целью изобретения является упрощение способа и повышение стабильности и чувствительности комплекса 25ЕАС 1,4,2.Указанная цель достигается тем,что согласно способу, включающемупоследовательное присоединениек ЕА комплексу очищенных Фракций 30комлемента С 1, С 4 и С 2 , присоединение С 2 фракции комплемента осуществляют с помощью третьего реагента К 3, окисленного йодом,П р и м е р 1, Приготовление К 3и его окисление в охуК :10 мл сме 3шанной сыворотки (от 15-20 человек)ресуспензируют осадок зимозана, полученный из 5 мл исходной взвеси. Полученную смесь помещают в водяную банюпри 37 С на 1 ч с помешиванием через10 мин. После прогревания смесь центрифугируют, Центрифугат К 3. 77.при 4 оС, после чего комплексЕАС 1,4,2 оху образован и может бытьприменен в микро- или макровариантеспособа определения С 3,Постановка макрометода определения С З-фракции.Обычным методом готовится 17-аягемосистема (ЕА), к которой добавляется охуК 3 в количестве 5 мл реаген-.та на 100 мл гемосистемы, Полученную смесь вццерживают 15 мин при 4 С,в результате чего образовывался комплекс ЕАС 1,4,2Испытуемую сыворотку прогреваютпри 52 С в течение 30 мин.Основной опыт ставят по схемеприведенной в табл,1.Пробирки выдерживаются в термостатепри 37 С 1 ч, после чего производится определение активности С 3 по1003-ному гемолизу в соответствиисо второй схемой приведенной втабл,2.Постановка микрометодом. К 5 мл охлажденной 27-ной гемосистемы (ЕА)добавляют 0,25 мл цельного окисленного иодом реагента (охуР ), выдерживают 15 мин при 4 ОС для образованиякомплекса ЕАС 1,4,2, после чегосмесь подогревается до +45 С и смешивается с равным объемом охлажденнойдо 45 С 27,-ной агарозы.Полученную смесь тщательно перемешивают и заливают в камеру, приготовленную из двух фотопластин с П-образной прокладкой между ними толщинойО, 1 см, зафиксированной прищепками.После застывания геля верхняя пластина и прокладка снимается и в гелепробойником делают микролунки диаметром 0,2 см на расстоянии 1 см.В ряд лунок вносят гретую сывороткув различных разведениях: цельная1:20, 1:30, 1:40, 1:50, 1:б 0, 1:70,1:80, 1:90, 1: 100. В остальные лункивносят опытные пробы гретой неразведенной сыворотки,Пластинку с пробами ставят вовлажную камеру при 37 оС на 3 ч.По истечении времени определяюттитр контрольной сыворотки (проба,где еще наблюдается заметный гемолиз)и измеряют диаметры опытных проб.Гемолитическая активность контрольнойсыворотки равна обратной величинетитра в .гемолитических единицах намиллиметр (гем,ед,мл),1097277 4тивность СЗ, способная гемолизироватьвесь введенный комплекс) и смесь инкубируют при 37 оС в течение 1 ч.Полученные результаты показывают следующее: комплекс ЕАС 1,4,2 при егохранении при ОоС уже через 2 ч начинает распадаться, о чем свидетельствует неполное его разрушение в реакции с добавлением СЗ (на дне после10 центрифугирования. реакционной смесипосле инкубации остается небольшойосадок неразрушенных эритроцитов). Активность опытной пробы определяется по формуледохСо-кгде С - активность С 3 в опытнойопробе,1С - активность С 3 в контрокле;Д - диаметр кольца лизиса воопыте,Д - диаметр кольца лизиса вкконтроле.Введение в способ определения С 3фракции комплемента оксиленного третьего реагента ОХУ Р и обработкиисследуемого материала при 52 С в теочение 30 мин позволяет значительноулучшить метод определения С 3-фракции комплемента, Это выражается увеличением чувствительности (в 2030 раз), его специфичности, в еготехническом упрощении. В результатевозможна постановка высокочувствительного метода определения важного 25лабораторного показателя (С 3).Для доказательства повышения стабильности и чувствительности к С 3комплекса ЕАС 1,4,2 0"1 по сравнениюс комплексом ЕАС1,4,2 прототипа 30проводят следующие эксперименты,Прогретую исследуемую сывороткуразводят 1:20, 1:30, 1:40, 1:80,1:90, 1:100, 1: 110. К разведениямисследуемой сыворотки добавляютсоответственнокомплекс ЕАС 1,4,2и полученный данным способомЕАС 1,4,2в рабочей дозе (17взвести. комплекса в объеме 1 мл к0,5 мл разведенной сыворотки). Через 401 ч инкубации при 37 С производятучет результата по 1007.-ному гемолизу. Титр исследуемой сывороткипри работе с комплексом ЕАС 1,4,21:30, предлагаемый - 1: 100. Это свидетельствует о большей чувствительности предлагаемого комплексаЕАС 1,4,2 присоединять находящийОХМся в исследуемой сыворотке С 3Этосоответственно повышает в конечномитоге разрешающую способность методаопределения СЗПригото:.ленные комплексы ЕАС 1 4 2гСХЭ Эи ЕАС 1,4,2 выдерживают при ОоСо, оЭ37 С, 40 С 15 мин, 30 мин 1 ч, 2,5,10 ч,Затем комплексы вносят по 1 мл в пробирки с прогретой исследуемой сывороткой, взятой в рабочей дозе (акПри хранении данного комплекса при 37 С его заметное разрушение начинаоется через 60 мин, при 40 С - через 15 мин. В то же время комплек ЕАС 1,4,2 " хорошо сохраняется приОХУь0 С и после 10 ч инкубации выявляется незначительная потеря его активности. Признаки снижения активности комплекса ЕАС1,4,20"при хранении прио37 С появляются только через 5 ч, при 40 С - через 2 ч. Таким обраОзбм комплекс ЕАС 1,4,2 более стабиО)Рб лен по сравнению с ЕАС 1,4,2 про 1тотипа. Данный способ получения комплекса ЕАС 1,4,2 при помощи (К.) имеет преимущества перед известными, так как получение ЕАС 1,4,2 первыми двумя известными способами при помощи неразведенной сыворотки (имеются все компоненты, в т.ч. и С 3) требуют соблюдения строгих режимных условий блокировки присоединения С 3 к ЕАС 1,4,2 температурой или формальдегидом, что усложняет выполнение метода. Для последующей работы с комплексом необходима дополнительная стадия отмывки полученного комплекса от С 3,1 что требует дополнительной затраты времени и не безразлично для сохранения функционально активного ЕАС 1,4,2 принимая во внимание его лабильность, Эти недостатки нивелируются при применении третьего реагента, который получается несложным способом и длительно может сохраняться. Получение комплекса ЕАС 1,4,2 становится упрощенным и представляет собой простое смешивание оптимальных количеств гемосистемы (ЕА) и К за 15 мин до опыта.Использование К для получения комплекса ЕАС 1,4,2 значительно упрощает способ. Окисление иодом С 2 и введе,1097277 ние С 2 У в состав комплекса позволяет более стабильный и более чувствительный к СЗ (в 20-30 раз) комплексЕАСф 1,4,2 о. Ряд пробирок13 111 1 Контроль Ингредиенты 4 5 6 7 1 2 3 Гретая сывороткаиепытуемая 1;40 0,1 0;15 0,2 0,25 О,З 0,35 0,4 Вероналовый буФер Пиллимера 0,5 04 035 03 025 02 015 01 13-ная вевеськомплемфЕА С 12 ф1,0 Таблица 2 Разведение исследуемой сыворотки по пробиркам АктивностьС 3 1:57 1:80 1;66 1: 200 1:133 1: 100 1:50 в ге- молизе,ед/мл 133 80 100 П р и м е ч а н и е.ф (+) - есть гемолиз, (-) - нет гемолиза Составитель Г,КрюковаРедактор М.Товтин Техред М,Кузьма Корректор А. Тяско.Заказ 4086/4 Тираж 688ВНИИПИ Государственного комитета СССРпо делам изобретений и открытий113035, Москва, Й, Раушская наб., д, 4/5ф ф+штвшЮ юф 1филиал НН патент", г. Ужгород, ул. Проектная,Подписное Исследуемая проба,Ф Способ может быть использован иммунологами, патфизиологами, аллергологами, онкологами при определении функциональной активности СЗ.Таблица 1