Способ получения сорбента для очистки вирусных суспензий

ОЮЭ СОВЕТСКИХкцембН аеПУБЛИК 001 20/10; С 12 й 7/02 КОМИТЕТ СОСР ИЙ И ОТНРИТИЙ ОСУДАРСТВЕННЫЙО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕН ИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ ОРСЯО, ДЛЯ ОЧИСТКИ ВИРУСНЫХ СУчающий обработку кремнеземсориала - аминопропилтризтокснсилантом натрия в присутствии кислч а ю щ ий с я тем, что, с исорбционной способности к вирботки смесью нитрита натрия иземсодержгщнй ьйтериал лодверствию с й-виннлпирролидономраствором в присутствии солян2. Способ по и. 1, о т л и чтем, что используют водный растипирролидона с концентрацией не(71) Институт полиомиелита и вирусных знцефа. литов АМН СССР и Всесоюзный научно-исследо.1 вательский биотехнический институт(56) 1. Молодкина Л, М. и др. Методяка моди. фицирования макропористых кремнеземов помвинилпирролидоном. Труды института нм, Пастера "Этнология и специфическая профилактика гриппа". Л., 1979, т. 52, с. 92.2, Мчещтишвили Б. В. и др. Жидкостная си. тоня хроматография вируса гриппа на модифицированных пористых стеклх. Труды института им. Пастера "Убитая гриппозная вакцина". Л., 1976, т. 47 с, 43-49 (прототип). ИЯ СОРББНТА СПЕНЗИЙ, вклюдержащего мате.ом и нитри. оты,о тлиелью снижения усам, после обракислоты, кремне гают взаимодей. или его водным ой кислоты.ающийсяор й.винил- ниже 30%.Изобретение относится к способу получениясорбента для очистки вирусных суспензий иможет быль использовано при производствевирусных антигенов и вакцин.Известен способ получения сорбента для очистки вирусных суспензий, включающий многократную обработку макропористого кремнезема рас.твором поливинилпирролидона с последующейтермообработкой в течение 24 ч 111,Однако известный способ длителен. Недостаточная стабильность получаемого сорбента,обусловленная непрочной связью кремнезема,приводит к загрязнению вирусной суспензиямодифицирующим агентом.Наиболее близкаа к предлагаемому ио тех; 15иической сущности и достигаемому результатуявляется способ получения сорбента путем по.следовательной обработки стекла.аминотри.этоксисиланом и смесью нитрита натрия и со.ляиой кислоты 121. 20Получаемый сорбент с оксипропипьньумигруппами сорбирует не только примесные белкииз очищаемой вирусной суспензия, но и вирус-:ще частицы, что приводит к снижению выходоввируса, 25Цель изобретения - снижение сорбциоинойспособности к вирусам.Поставленная цель достигается тем, что са.гласно способу получения сорбента дпя очисткивирусных суспензий, включающему обработкукремяеземсодержащего материала.аминопронпилтриэтокеисиланом и нитритом натрия в присутствии кислоты, после обработки смесьюнитрита натрия и кислоты кремнеземсодержащий материал подвергают взаимодействию сЙ.вииилпирролидоном или его водным раство.35ром в присутствии соляной кислоты.Используют водньй раствор й-виюпширроли.дона с концентрацией яе ниже 30%.Кремнеземсодержащий материал с оксинро.пильными группами может быть также полученпутем обработки оксипропилсиланом в видетриметилсилилового эфира или в виде эфирауксусной кислоты с последующим удалениемзащитной группы.45П р и м е р 1. К 50 мл стекла МПС-.2000 В прибавляют 50 мл 5 ф-ного раствора.ф -аминопропилтриэтоксисилана в ацетоне,перемешивают и выдерживают при 100 Свтечение 6 ч. К модифицированному стеклу при.5 Опинают 100 мл 0,1 н. раствора соляной кислотыи порциями в течение 0,5 ч прибавляют раствор2 г нитрита натрия в 10 мл воды, перемешиваюпеще 2 ч и промывают водой, Количество оксипропильных групп, определенное по разности 55исходных и не вступивших в реакцию амияогрупп, составляет 0,4 мг-экв(г, Не вступившиев реакцию мияогруппы отсутствуют. К, 30 мл модифицированного стеклаМПС - 2000 В добавляют 30 мл й-винилпирролидона и 0,1 мп концентрированной солянойкислоты, перемешивают 2 ч, промывают водой,раствором бикарбоната натрия и снова водой.Контроль отмывания модифицированного сорбен:та от не вступившего в реакцию .Й.винилпирропидона ведут по отсутствию поглощения при230 нм. Модифипированное стекло высушиваютна воздухе при 60 фС. Содержание азота 0,59%.В ИК.спектре имеется интенсивная полоса поглощения при 1650 см (СО - ИЯ).Полученный сорбент вносят в хроматографическую колонку размером 1 х 10 см, которуюуравновешивают 01 М гадис.НС 1 буфером срН 7,8. В колонку вводят 1 мл алантоиснойжидкости, содержащей вирус гриппа А Техас,и проводят элюирование буфером, подавая егосо скоростью 2 мл/мин ем=. На выходе колонкисобирают фракции объемом 1 мл,В 4 и 5-и фракциях элюата собирают 90%очищенного вируса гриппа, примесные белкии низкомолекулярные вещества злюируются в6 - З.и фракциях энюата. Содержание, примесногобелка в очищенной суспензии вируса гриппасоставляет 0,01 мл/мл (в исходной алаитоиснойжидкости 2,5 мг(мл),степень очистки 99,6%.Потери вирусного материала отсутствуют,Аналогично проводят очистку вируса группыА/Виктория/72; Выход вируса 90%, степень очистки от примесных белков 99,2%.Иснытания модифицированного носителя пока.зывают, что выход вируса гриппа при очисткене зависит от штамма.При использовании оксипропилстекла ЫПС в 20.В в аналогичных условиях сорбируемость вирусагриппа достигает 95%, соответственно 1 выход ви.руса состанлят 5% Последующее промывание колонки 0,1 М цвс-НС 1 буфером с рН 8,6, содержащим 05 М ЙаС 1, приводит к десорбции 40%внесенного в колонку вируса. Потери вирусногоматериала 55%И р и м е р 2. При модифивдровании стек.ла МПС - 1000 В в условиях примера. 1 получаютстекло с содержанием оксипропильных групп0,26 мг-экв/г,К 10 мл стекла МПС - 1000 В с содержаниемоксипропильньтх групп 0,26 мг экв/г добавляют20 мл 50 ного водного раствора й винилпир.ролидона и 0,2 мл концентрированной солянойкислоты и далее обработку ведут аналогичнопримеру 1, Получают сорбент с содержаниемазота 0,4%, который используют дпя выделениявируса клещеного энцефалита из культуральиойсуспензии. Дпя этого колонку 0,8 х 12 см,заполненную полученным сорбеитом, уравновешивают 0,1 М к грис-БС 1 буфером с рН 8,0,В нее вводят 1 мл вирусной суспензии и злю.ируют укаэанным буфером, скорость злюирова4рролидона и 0,2 мл концентрированной со.ой кислоты, далее обработку ведут аналоо примеру 1. Получают сорбент с содеранием азота 0,7%, которым загружают колону размером 0,8 х 12 см. Колонку уравновещиают 0,1 М фосфатным буфером с рН 8,0 вводят в иее .1 мл инактивированной суспении вируса клещевого энцефалита (иммуногеность 27 ед, ПР 1 д, концентрация белка 70 мкг/мл). Вирус элюирует фосфатным бу.ром, которым колонка уравновешена, элюат обирают во фракции объемом 1 мл. В 3 и 4.й ракциях элюата собирают очищенный вирус (23 ед, 1 е, концентрация белка 6 мкг/мл),6-8-й фракциях элюируются примесные лки. Выход вируса из колонки 85%, степень чистки от белков 99,2%Таким образом, сорбент, полученный предло-.нным способом, позволяет проводить зффек.ную очистку вирусных суспенэий беэ потерь ирусного материала с высокой степенью чистки от примесных белковСоставитель Н, СтрогановаТехред Л.Пипипенко. Корректор А, Тяско Редактор Т. Веселова Заказ 8/4 Тираж 533 ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж, Раушская наб;, д. 4/5Подписное Филиал ППП "Патент", г. Ужгород, ул, Проектная,4 3 1071306 ния 2 мл/минем. В 3 и 4-и фракциях элюата пн собирают вирус, в 6-8-й фракциях элюируются лян вирусные белки, Выход вируса иэ колонки 95%. гичн Содержание примесного белка в очищенномж препарате вируса клещевого энцефалита 5 к 0,007 мг/мл (в исходной суспенэии 1,1 мг/мл) в степень очистки 99,6%. иПри использовании оксииропилстекла в анало. з г"- .л/ гичных условиях сорбируемость вируса клещево. н . го энцефалита 50%. Соответственно выход очи 10 8 щенного вируса составляет половину от внесен- фе :,ного в колонку. При более жестких условиях при использовании для элюирования вируса ф 0,1 М рис-НС 1 буфера с рН 8,5, содержащего 0,5 Ы ИаС 1 ) десорбция вируса не наблюдается,5 ВП р и м е р 3, К 50 мл силохрома Сбе прибавляют 50 мл 7%.ного раствора 3 -ы. нопропилтриэтокс 1 тсилана в ацетоне и далее процесс ведут как и примере 1, количество же оксипропильных групп 0,49 мг-зкв/г, 20 тивК 30 мл модифицированного силохрома С - 80 в добавляют 60 мл 30%-ного .раствора И-винил. - о