Способ получения вакцины против гепатита в

(23) Приорите (31) 631961 С 12 К 5 00 сударственный комитет СССР о делам изобретений и открытий2) Авторы изобретения ИностранцыРед МайеР ПРинс, Александер Роберт Ньюрат (США)Джон Внек (ЧССР) и Кристиан Трепо (Франция) Заявитель Иностранная фирмаДзе Коммьюнити Блад Каунсил оф Гре-йорк, Инк 54) СПОСОБ ПО 5 15 Изобретение относится к медицинской промышленности и касается производства бактерийных препаратов,Известен способ получения вакциныпротив гепатита В путем выделениячастиц НВзАЧ, содержащих е-антигенна частицах или в растворе, из плазмы крови носителей антигена гепатита В, содержащей е-антиген с последующей инактивацией целевого продукта 1), Однако вакцина, полученная .известным способом, не обладает высокой специфичностью,Целью изобретения является повышение специфичности вакцины.Эта цель достигается тем, чтоплазму кровиобрабатывают 3,04,5 вес.Ъ полиэтиленгликоля при РН4,4-4,7, полученный осадок, содержащий НВзАд частицы размером 30-50 нм,растворяют при РН 4,9-5,1, затемРН надосадочной жидкости доводятдо 4,4-4,7, повторно обрабатывают полиэтиленгликолем и полученный осадокрастворяют в физиологическом растворе.Кроме того, целевой продукт инактивируют обработкой формалином или)з -пропиолактоном или облучениемрентгеновскими лучами. Я ВАКЦИНЫ ПРОТИВ ГЕПАТИТА В Предлагаемым способом получают вакцину против вирусногогепатита, которая включает в свой состав антигенные частицы, имеющие размер час тиц 20-50 нм, причем эти антигенные частицы содержат неосажденные свобод ные необъединенные гепатит р-поверхностные антигены. Вакцина имеет менее 10 единиц антител гепатит Р -поверхностного антигена на 1000 ед. ге патит )з-поверхностного антигена, 5 частиц с размером, лежащим в интервале 3-50 нм, содержат неосажденные е-антигены или специфичные антигены, аналогичные частицы Дана. Антиген гепатита и е-антиген содержатся в вакцине в количестве, достаточном цля образования антител при введении йх в организм животного.Для получения вакцины против гепатита В используют материал, состоя щий из плазмы, полученной из хронического носителя, который содержит антигены. Такая плазма также содержит большое количество частиц Дана и волокон, не содержащих объединенного анти-е-антитела. Плазма может быть получена от клинически здоровых человеческих хронических носителей нВ, а также от шимпанзе, которыхестественно или искусственно инфицировали вирусом НВ и которые становились хроническими носителями е-антиген положительного НВвАд.Исходный материал должен быть бактериологически стерильным и долженбыть свободным от присутствия адвентициальных вирусов,Очистку проводят обычным способом.Из антигенсодержащего веществакрови удаляют примеси путем подкисления до рН 4,4-4,7, Выпавший осадоквместе с клеточными остатками удаляют центрифугиронанием в течение20 мин со скоростью 10000 об/мин.После этого материал смешивают с2,5-4,5 вес.Ъ полиэтиленгликоля,5предпочтительно с 3,0-4,5 вес.%. Более низкие концентрации, например3-4, могут осаждать крупные формычастиц и поэтому при определенныхобстоятельствах являются предпочтительными. Весовой процент полиэтиленгликоля рассчитывают по отношениюк общему весу смеси, Таким образом,осаждают антигенный материал, содержащий гепатит В с более крупным 25размером частиц, например 30-50 нм,а также часть материала, содержащегооболочкоподобный гепатитный В поверхностный антиген. Осадок, содержащийНВзАд, регенерируют, и добавляют некоторое количество воды при рН 4,9 -5,1, Образуется осадок, содержащийбелковое вещество и полиэтиленгликоль, а жидкая фаза - надосадочнаяжидкость, содержащая НВзАд, содержитчастицы Дана или волокнистое вещество,рН недостаточной жидкости доводятдо 4,4-4,7. Затем ее смешиваютс 3,0-4,5 нес,Ъ полиэтиленгликоля,считая на общий вес смеси, с образованием осадка, содержащего очищенные частицы, содержащие НВзАд поверхностный антиген, имеющие оболочкообразную конфигурацию с размером частиц 20-30 нм и волокнистые частицы,содержащие НВзАд и е-антиген, который не содержит какого-либо анти-е-антитела, причем волокнистые частицы имеют диаметр 20-50 нм, а такжечастицы Дана со сферической конфигурацией, имеющие размер 40-50 нм и 50имеющие липопротеиноную внешнюю сферу, содержащую НВзАд и е-антигены,а также содержащие сердцевину, включающую ДНК, ДНК полимеразу и НВзАд.В результате регенерируют очищенный антигенный материал. После этого его обрабатывают с целью инактинации вируса, а полученный осадокрастворяют в физиологическом раствореТемпература каждой из смеси после 60каждой стадии смешивания поддержинают в интервале О-ВО С в ходе образоЯвания осадков. Стадия очистки облегчается, если регенерацию усиливаютврезультате центрифугиронания с 65 последующими стадиями осаждения,Полиэтиленгликоль используют н видеводного раствора, который содержит30 вес.В полиэтиленгликоля. Такойполиэтиленгликоль имеет мол. вес.500-50000, предпочтительно около 6000.Дальнейшую очистку осуществляютпутем адсорбции очищенных антигеновна гидроксилаппатите с использованием хроматографии, Частично очищенные антигены пропускают через хроматографическую колОнку, содержащуюгидроксилапатит, на котором они адсорбируются. Дополнительно очищенные антигены затем регенерируют сиспользованием мчогоступенчатогоэлюирования. Частицы с размером 2550 нм регенерируются отдельно отфракций с частицами более мелкогоразмера (16-22 нм) и от основной массы сывороточных протеинов. Послеочистки фракция более крупных частицможет быть инфекционной. Для этогоосуществляют инактивацию, Целевойпродукт инактинируют обработкойформалином в концентрации 1:2000 втечение 4 дней при 37 С с использованием обычных методик или облучением рентгеновскими лучами, Вакцинуосветляют путем фильтрации черезМ 111 ъроге 0,22 Д фильтр или эквивалентный фильтр перед добавлениемформалина или ) -пропиолактона.После инактивации конечный продукт подвергают диафильтрации с использованием Гап 1 соп РПЗО фильтраили эквивалентного фильтра против0,9 ИаС 1, содержащей 1:10000 ТП 1 ощегаза 1 и любой стабилизатор, дляудаления низкомолекулярных соедине-ний, используемых для инактинации,затем стерильно фильтруют и соответствующим образом разливают в стерильные ампулы для модификации илизамораживания, Вакцину используютна отсутствие инфекциозности, иммунологическую активность.Вакцину можно применять путемподкожной или ннутримышечной инъекции. Применяют обычно около днух дозв месяц с последующим введениемвспомогательного вещества н периодот 6 мес. до 1 года после перничнойиммунизации, Первоначальная дозировка зависит от веса организма, а последующие дозировки - в зависимостиот уровня антител в крови после первоначальной иммунизации.Использование получаемой вакциныпротив гепатита В предотвращает хроническое заболевание печени.П р и м е р 1Очистка и определение НВ ассоциированных частиц из7,8 л плазмы от одного шимпанзе-носителя НВзАд,Вещества и методики. ИсточникНвзАд,Антиген очищают из объединеннойплазмы носителя шимпанзе, преднари 728720тельно инокулирэванйого человеческой НВэАд - положительной.плазмой, относящейся к айп подтипу. е-Антиген присутствует на поверхности способных к идентификации частиц Дана и используемой плазме.Очистка НВзАд и е-антигена.НВзАд и е-антиген выделяют из плазмы путем осаждения с помощью полиэтиленгликоля (РЕС). Повторно суспендированный осадок НВэАд и е-анти- гена очищают хроматографированием на колонке с гидроксилапатитом. Конечные стадии очистки включают плотностное градиентное центрифугирование.Осаждение НВзАд и е-антигена с по мощью РЕС.На стадии, предшествующей очистке 7,800 мп НВэАд и на содержащей е-антигена плазмы, устанавливают рН 4,6 и добавляют 30-ный раствор 20 РЕС в дистиллированной воде до приблизительно 2 концентрации. Раствор оставляют на ночь при 4 С и осветляют центрифугированием НВзАд во всплывшем слое, осаждают увеличением концентрации РЕС до 4. Всплывший слой после стояния в течение ночи при 4 С декантируют и отбрасывают. Осадок НВзАд (содержащий е- антиген) ресуспендируют до 500 мл в дистиллированной воде. Основную часть РЕС с некоторыми примесями осаждают, устанавливая рН раствора равным 5,0 и осадок удаляют центрифугированием. Прозрачный верхний слой доводят до рН 4,6 и НВзАд и ассоциированный с частицей е-А НВзАд (е) осаждают в результате добавления 30 раствора РЕС до конечной концентрации 4. НВзАд/е удаляют центрифугированием после стояния образца в течение но чи при 4 С, Наконец, осадок НВзАд/еоресуспендируют до 320 мл в дистиллированной воде.Хроматографирование на колонке с гидроксилапатитом. 4450 мл ресуспендированного .РЕС осадка НВзАд/е пропускают через колонку 6,5 Х 16,5 с гидроксилапатитом и элюируют прерывистым градиентом фосфатного буфера. В следующем экс О перименте 200 мл образца подвергают частичной очистке на колонке 6,5 х 35 см с гидроксилапатитом. НВзАд, элюированный совместно с первым протеиновым пиком, пропускают55 через колонку с гидроксилапатитом во второй раз.Плотностное градиентное центрифугирование.Фракции НВзАд, выделенные хроматографированием на колонке, очищают 40 скоростным зональным центрифугированием. Прерывистый градиент получаютпри использовании 3 мл 60 и 7 мл40 сахарозы в 0,02 М натрийфосфатном буфере при рН 7,2 (содержащем0,02 ИаНу) .В каждую пробирку загружают по20 мл образца и центрируют на Яр 1 пзоБИ 25,1 роторе при 18000 об/мин в течениЕ. 18 ч.Фракции объемом 1 мл собирают по каплям со дна пробирок ианализируют на содержание НВзАд,Фракции, содержащие максимальное количество антигенной активности, объединяют, тщательно диализируют иконцентрируют ультрафильтрацией сиспользованием мембраны с 30000 МХотжимным рантом (Амикон РМ) Концентрированные фракции НВзАд подвергают конечным стадиям очистки изопикническим связыванием в линейномградиенте СяС 1 и скоростному зональному центрифугированию в прерывистом градиенте сахарозы при обычноиспользуемых условиях.Методы детектирования,За содержанием НВзАд следят методом встречного электрофореза (СЕР)или твердо-фазной радиоиммунопробойАцзг 1 а 1 или 11, АЬЬо 11 ЬаЬога 1 ог 1 еэ,Концентрацию протеина устанавливаютпри 280 нм сиспользованием микрометодики К 3 еЬ 1 йаЫ,Критерий чистоты НВзАд,Образцы после каждой стадии очистки анализируют методами целлюлозоацетатного электрофореза, иммуноэлектрофореза и испытаниями диффузиив системе агарового геля по отношению к поливалентной аытинормальнойчеловеческой плазмапротеиновой антисыворотке.Полиакриламидный гелевый электрофорез.Аликвоты образцов, содержащие0,01 натрий фосфатный буфер прирН 7,2, 1 натрий додецилсульфата,1-меркаптоэтанола и 10 глицерина,нагревают в течение 2 мин на кипящей водяной бане, обрабатывают 7,510 найтрийдодецилсульфатакриламидныгелями.Результаты очистки НВзАд/е положительных сывороток осаждением с помощью полиэтиленгликоля представленыв таблице. Около 87 первоначального протеина плазмы удаляются на первой стадии осаждения НВзАд (котораявключает предочистку при концентрацииРЕС 2) . Конечный выход после двухпоследовательных стадий осаждения спомощью РЕС лрказывает количественнуюрегенерацию НВзАд в присутствии лишь4 первоначальных протеинов.Очистка объединенного НВзАд шимпанзе осаждением с помощью РЕС.728720 Образец ь и ПервоначальнаяНВяАд-плазма 100 7,800 512 429,0 Первое осаждение4 РЕС 89 6,9 55,0 7,080 500 20 7 16 б 80 Второе осаждение4 РЕС 320 10 000 50 мл ресуспендированного РЕСосадка НВяАд фракционируют хроматографированием на гидроксилапатите.Элюат группируют на семь фракций,которые диализируют по сравнениюс 0,02 М натрий-Фосфатным буферомпри рН 7,2 (содержащим 0,02 азицанатрия) и концентрируют ультрафильт Орацией. Концентрированные образцыанализируют на протеины при 280 нми на присутствие НВяАд методом СЕР.200 мл ресуспендированногоРЕСосадка НВяАд Фракционируют на 1000 мл 25колонке с гидроксилапатитом. Фракции НВяАд из первого протеиновогопика (группа 1: фракции 38-83) иоставшийся элюат (группа 11: Фракции84-110) объединяют и концентрируютдо 75 мл ультрафильтрацией.Концентрированный образец изгруппы 1 повторно хроматографируютна колонк объемом 1000 мл с гидроксилапатитом,35Элюат объединяют на восемь фракций. Объединенные образцы концентрируют ультрафильтрацией и промывают0,02 М натрий-фосфатным буфером прирН 7,2 (содержащим 0,02 азида натрия), Эти образцы анализируют на 40протеин и НВяАС,Анализ образцов на содержание примесей методом иммуноэлектрофорезаобнаружил очень слабую линию преципитации во фракции 1, более сильнуюлинию во фракции 8 в Ф и сильно выраженную широкую линию в объединенныхфракциях 1 И-ЧО, которые мигрируютмежду альфа и альбуминной областями,50Электронная микроскопия образцовобнаружила в основном сферическиечастицы с диаметром 22-28 нм воФракциях 1 - и, сферические частицыи волокна, но фракциях В -М , гла.внымобразом небольшие сферические частицы и некоторое количество волоконно фракциях Ч 1 ч Чв.Концентрированные образцы из предыдущих стадий подвергали полнойочистке плотностным градиентным центрифугиронанием,Очищенные препараты НВяАд, состоящие главным образом из сферических частиц диаметром 20-22 нм, сферических частиц диаметром 22-28 нм, Я волокон различного размера и частицДана, содержащих по 100 мг протеина,анализируют на полипептидный составполиакриламид гелевым злектрофорезом.Количественную разницу наблюдают нпротеиновых пиках индивидуальныхобразцов.Пики карбогидратов низкого молекулярного веса представляют собойгликолипиды, поскольку они не проявляются при голубом окрашивании поСоощаяя 1 е.Вакцину готовят из фракций крупных частиц, полученных в результатедобавления человеческого сывороточного альбумина с концентрацией0,5 мг/мл с последующей инактинациейпо сериям облучением от кобальтового источника (2,5 миллиона рад)инактивацией формалином с использованием общепринятых методик ( 37 С,96 ч, концентрация 1:2,000), с последующим использованием -пропиолактона по методикам, обычно используемым при производстве вакцин против бешенства.П р и м е р 2. Модифицированнаяусонершенствованная РЕС методика длявыделения НВяАд/е.Модифицированную методику дляосаждения РЕС используют на 2,6 лсмешанной НВяАд, содержащей плазмыот одного шимпанзе-носителя, содержащего е-антиген н необъединенном,неосажденном виде, рН плазмы устанавливают равным приблизительно 4,6и немедленно добавляют 30-ный раствор РЕС до конечной концентрации 2.Раствор вымораживают на льду н течение 30 мин (вместо стояния в течениеночи при 4 С, как в предыдущем примере) и осадок удаляют центрифугированием,Во всплывшем слое, содержащемНВяАд, устанавливают концентрацйюРЕС, равную 4 (нместо 4,5 н предыдущем примере) в результате добавления 6,6 ч на 100 30-ного раствораРЕС при комнатной температуре. Суспензию снова вымораживают на льдув течение 30 мин и осажденныйНВяАд/е удаляют центрифугиронанием.Осадок ресуспендируют до 200 мл вдистиллированной воде, Основную частьРЕС и сопутствующих примесей удаляютпутем установления рН, равным 5,0,вымаааживанием Оаствара на льду втечение 30 мин и удалением полученного в результате осадка центрифугираванием. рН прозрачного всплывшегослоя иэ предыдущей стадии вновь устанавливают равным 4,6 и добавляют 30%РЕО до конечной концентрации порядка 3 (вместо 40-4,5, как зтацелали ранее). Вещество вновь вымаракивают на льду в течение 30 мин изсацак НВяАс)/е удаляют центрифугированием.Осадок из предыдущей стадии, содержащий НВяАс 1/е, суспендируют в10 мл дистиллированной воды. Основ. ную массу РЕС осаждают в результатеустановления рН равным 5,0. ПослеОстояния в течение ночи при 4 С суспензию осветляют центрифугираванием.Прозрачный верхний слой, содержащийНВяА/е, дополняют 0,5 М натрий-фосфатным буфером при рН 7,2 до конечной концентрации порядка 0,02 И иустанавливают конечный объем, равный120 мя с помощью дистиллированнойводы.Результаты такой очистки показывают более чем 33-кратную очистку НВяАдП р и м е р 3. ФракцианираваниеНВяАа/е периодической обработкойгидроксилапатитам,Ресуспендираванный РЕС осадокНВяАЧ/е (пример 2) обрабатывают периодически гидраксилапатитом вместопроцесса хроматаграфирования на колонке, .500 мл объем насадачнага гидроксилапатита (В 1 О-Нас 1-1 аЬя) суспендиру.т в 800 мл 0,02 М натрий-фосфатнам буфере при рН 7,2 и после добавления препарата. НВяА/е перемешивают магнитной мешалкой в течение30 мин при комнатной температуре.Шлам делят на две равные аликвотыи центрифугируют в чашах емкостью1 л на центрифуге Яогуа 11 НСсоскоростью 4,000 аб/мин в течение10 мин. Верхний слой декантируют иосадок последовательно промываютпорциями и 1 л с 0,02 М и 0,05,на 1 трий-фосфатнага буфера при рН 7,2,Элюаты объединяют, концентрируютультрафильтрацией с использованиеммембраны РИи диафильтруют 0,02 Мфосфатным буфером с рН 7,., 0,02ИаН 3 и доводят да объема 60 мл тем)ке буферомКонцентрированный образец далееочищают скоростным зональным центрифугираванием в прерывном градиентесахаразы.Отделенные частицы НВяАЯ/е разделяют на три фракции, диализируют иконцентрируют ультрафильтрацией.Образцы,. исследованные методам электронной микроскопии, обнаружили главным образом крупные волокна и частицы Дана во фракции 1; волокна, частицы Дана и сферические частицы д)ламетром 22 -28 нм во фракции 11 и сферические частицы дламетром 20-28 нмво фракции 11,П р и м е р 4;:ДисаггрегацияНВяАу/е частиц с помощью ионных инеионных детергентов.НВяАс 1/е частицы обрабатывают прикомнатной температуре (в течение5 мин - 2 ч) следующими детергента 1 и; 0,5-2 ИО 11 Ые 1 л БР (детергент)(поверхностно-активный агент), 5-10Тритона Х(органический поверхностно-активный агент), 0,1-1,0додецилсульфата натрия и т.д. Цельюобработки является усиление антигеннай активности в образцах, обработанных детергентом, и инактивацияинфекциазности этих образцов.Оптимальные условия обработкиопределяют путем анализа образцовперед и после обработки детергентомс использованием тонкаслойной и изоэлектрической фокусировки. Индивидуальные компоненты дисаггрегированных образцов могут быть выделены сиспользованием различных методикразделения, например молекулярнымисключением, адсорбцией, способамиионообменного хроматографическогоультрацентрифугирования, различными методами электрофореза и т.д.Одним из наиболее высокоэффективныхспособов является метод занного конвекциОннагО изОэлектрическОГО фОкусирования, описанный ниже.Иэоэлектрическае фокусирование,Тонкие слои получают на Яер)1 ас 1 ех 75 гель целлюлазнога носителя в 1 ном растворе амфолина при рН 4,0-6,0или рН 3,5-10,0. Пластины помещаютв мультипоравое устройство. Отпечатки делают на хроматографической бумаге. Отпечатки разделяют вдоль линии отделенных образцов и разрезаютка зоны 0,5-1 см. Индивидуальные зоны далее разрезают на более мелкиечасти, смачивают 0,2 мл буферногосалевага раствора и элюируют 0,2 млнормальной (не содержащей НВяАд ианти-НВ) человеческой сыворотки,Аликваты в 200 мл из каждого элюатаиспользуют для радиоиммуноанализа.Полоски между разделенными обраэца.т также разреза 1 ат, элюируют 0,4 млдегазираваннай дистиллированной воды11 используют для измерениЯ рН. Еслиберут дга отпечатка, то первый используют для акрашивания на протеина второй разрезают для радиоиммуноанализа на НВяАу и измерений рН.АЛИКВату иэ КаждОГО Образца обрабатывают 5-10 неионного детергентаТрито 1 л Х) в течение 20 мин прикомнатной температуре перед контактированием с гелем и выдерживают приописанных выше условиях при сравнении с образцом, который еще не обрабатывали детергентами.ч " - ;.,Е 0.ОНИ 3 й Хрос 1 а Огра. ": с;:,с,КаПаТИТЕ ацалЗИ". .0 Г 1Ной ИЗОЭЛЕКТрИЧЕСКОЙ фс, Сг; 03;С:Препарат, состоящий3;,о. об 3Из СфЕРИЧЕСКИХ Чаотиц да Е.ПС". 2.28 нм й гетерот енной .:мес., Г 1 йр:кс 1 Цей Б Основном более яр; г:ье ч,ай:тиы , ВОлокн а чост ь:. , Нацдпе:оцСТОИОуЕТ от НОСИТЕЛ ЬНС Ьь 3 й Г.". я Гс:.,ГЕтЕРОГЕННоогти В ПОВЕРХОСТНОМ заппде частиц., Основной пик ант;Ге;иойа к ти В ц 0 с т и Оьл о б ь а рж е 1 1; и р Н " 8и два незначительных тика гк гивцог;ти набладоли при рЫ 40- 4 г 1 и рН4 г 4 -4 6. Образцы после Г бработкирит 01 ом 1-100 гоазьвакт двурат.ОЕ ПОВЬ.ЕЬИЕ ац ТИГЕНЬой;ТИВ:,ОСТсВ .,ругих экс 1 ериментах наблюдалиГОЯЬБВЕ 1 ИЕ актИВНОСТИ В 2 -8 рс.з. .роме некоторой остаточной антигенцойактивности, наблюдаемой в первона"сН ОЙ 0 ОЛ с 1 СТИ Н И 3 КИ Х 3 Н а ЧЕ Н И ИрН рН 41-5,0) основные пики антиГенной активности были обнаружсныри Оо 1 ее высоком с нтерв сле рН Оя5,3,цо 5,9 и незначительный пик прирН 7,1-72., е- Антигенная актиьностьОЬа 00 наоужена лишь В интервдлеОН -, О -г 4. ЭОт =нтиГен был ООцаруи ец В 3 ой облас и неувствител10 ЬТсг 1 ИЕМ .циффуЗИИ На ХЕЛ аГсраКонечный Вакционньй продукт голу.чаюг по методике примера 1 с использованием человеческого альбумина иметоцик инактивации с желаемой фракцией после детергентной ассоциации,П р - и е р 5. Очистка. растйорпмото с -антигеа из плазмы хроци ес-"ких носителей НВяЛа/е для .спользо.ца:Ия В КоЧЕСТВЕ ВаКцИНЫВяе 19,е положительная плазма. Оо"цзржит е-днтиген й раГтвор 1 м 01. , - д,Ц Е сССОЦИИ Ро ВЭг 1 ой С ЧдСТИЦЕЙ, ИЛИЯ - 1000000) форме то.кая 60 рмапревалирует Во многих плазмах такоготиг.а и поэтому может престд для.ьсобой иДеал ьнаЙ истоц ик е ан. Ген =.для иммунизации,Свойства растворимо о е-ацтигепдОыли определены как следующие: плот"ность СяСТ/1,28-.,29; 82 о= .1.16,молекулярный вес 150000-900000; изоэлектрическая точка 5,5-6,6, элюироВдние из диэтиламиноэтил целлюлозыри 0 15 г 1На основании этих свойств бьгп разргбОтан слеДующий способ Очистки.,НВяЛ 9/е плазму вначале частичноосаждают РЕС 6000 с удалением НВямтассоциированных частиц и некоторыпротеинов сыворотки в результатеОСсаждЕНИя 5-9, ПрЕдПОЧТИТЕЛЬНО 8":.Вес/обьем, РЕС 6000 при рН 7,.0 20 Сс последующим осаждением е-антигенди некоторых протеинав плазмы с понощью РЕС при 9-13 РЕС концентроции.ЦНИИ Заказ 1.171/54 ".:ифилиал ППППатент, 1-,СсДС .-" с гЕГ" ,1= 1, , РУБ В, ; ".равСПЕ:Г.1 г. Е 1буфЕООМ, Зг:ЮИРойап-Е ОГ: Е сй.ййТ . ЛЦЕЙЦЫрад 1 еОг О,01 ." .аС 1 В,тог 3 еб, фЕ Е, .ЬгЗ1;51 ЮПри4 ВСХ с высокой Г,еецью чис 1 го :1.1 ОС Е 0 ГЕИ ТОИООВ дн Я ГГО ИЛ Ь Т -дцией 0.таюнесяри.;еси усдля стОКО 100 НЬ.ЗокдЛЬ М ДЕг ТоифуГИро- В;ц;ем л 10 30 ь гоадиенте сахарозыили эквивалентном 1 Лотностном гра,дте с ре.енерацией ,6 пика,Ссиеццьй естаилизируот дсбВВЛЕНИЕМ дЛЬбУМГИнс сЕЛОВЕЧЕСКОЙсыворотки до конентрации порядка01 г/м ,Такие препараты при: концентрацииОколо 20 икГ но. Д 03 У мо Ут быть использоваы В качес 1 йе вакциць противГЕПатита Б ПОСЛЕ ИйаКИВВНИИГтЕ.,И . о .ПрГдлс.ГсГ".Сс соб гозвол.ет;О= Вьсит ь 010 .1 фи чо от ь пс л у 1 ае 10 Й йд к15 , НЫфор, .а Г 3001: -". енияСпоооб ПОТсГ ция Вакцин. 1130-ТИВ ГЕ 1 сТИд.Гу". -И ВЬДЕЛЕцсЯ Чао -Т ИБ я АО, Сц д р гаЬ Х Еа 1. Т И ГЕН аропп 1 осите;ес аь: гена Гепати 5=-. В,СОДЕэждЩЕЙ с3 ТГЕИ 3 5 ОС.ЕйГЮ -ЙИ 1 аК "вс 1 И" игЛЕБОГО ро КТВО Т.ЬЮ ОЭЫ 1-1 К.Г, СЕ :;: ЬЦОСТН Вс 11: Ы.ла 31 у кров-.:;:брсба.Иват 304, -, веГ,ПГлэтилег Гли коля при рн4 4 - 4, 5 тол они 3 ОГадок. содержа=Ций НВяАс чсс".1 ы О =.Зкеодм 30 - :0 цм.Стго 5 Ютр; 4 9рН цацосадс;.ной жидкое ги Доводят до- ПООб С-Л и ". с 1тя гсзсГ 1 Е 1 Е Ьгй Продукт