Способ выделения лизоцима из молозива

ОЮЗ СОВЕТСНИХ ОЦИАЛИСТИЧЕСНИХРЕСПУБЛИН М 33 48 л"4 САНИЕ И РЕТЕНИЯ ПьСТВУ АВТОРСКОМУ(71) Московская ордена ТрудовоКрасного Знамени ветеринарная амия им. К.И, Скрябина(56) 1, Авторское свидетельство СР 178771, кл. С 07 С 7/02, 1966.2. Чеачег 1.Ь. Кгойег М. Реалей СЬС 1 п АГГ 1 п 1 у Сгоща 1 одгарЬуа МеСЬой Гог 1 зо 1 а 1 хоп РцгГдсаСдапб сопсеп 1 гаСоп оГ 1 увокуще.-Х,Яс 1 епсе, 12, 1084(1977),(54)(57) СПОСОБ ВЬЩЕЛЕНИЯ ЛИЗОЦИМАИЗ МОЛОЗИВА, включающий обезжирив исходного сырья с последующим фугированием, а целевой продук щают с помощью аффинной хрома ва фии на дезаминированном хитин. л и ч а ю щ и й с я тем, что е- лью повышения выхода и активн целевого продукта с сохранен:антигенной структуры, перед в СРвием целевого продукта к обез ному молозиву добавляют 0,1 а-.ный раствор сычужного фермейт тивностью 100.000+500. условны ниц в 1 г сухого вещества в с а : ношении соответственно 13-4):(. в течение 2-3 ч при 36-38 С,ние . рифугирование проводят при 10центри-, т очи- ограо т; тю го ак ост ыделе- жирен 0,2-: асак х еди- оот 1-2),опРоо ент 2000 д.щ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ. СССР ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЫТИИзобретение относится к биохимии,а именно к получению Ферментных препаратов, и может быть использоваггов иммунологии, гинекологии и акушерстве, терапииИзвестен способ выделения лиэсцима с использованием аффинной хроматографии 1 1.Недостатком этого способа является невозможность сохранения специфической активности Фермента в процес- го ,се обработки исходного сырья.Наиболее близким к предлагаемомуявляется способ, включающий обезжири. вание исходного сырья, створоживание с последующими центриФугированием и аффинной хроматограФией супернатанта 2 ).Согласно известному. способу к обезжиренному молоку добавляют 7-нуюуксусную кислоту до рН 4,5, центрифугируют, фильтруют, доводят щелочью рН до значения 6,5 и наносят на хроматографическую колонку с дезаминированным хитином, По результатам хроматографии выход фермента со специфической активностью около25 ,225 ед/мл составляет 95.Недостатком известного способа является низкий выход лизоцима, что снижает специфическую активность фермента еще до хроматографии. МалоактивЗ 0. ный лизоцим .слабо сорбируется на дезаминированном хитине, в результате чего не удается получить нативный ферментный препарат с высокой специфической активностьг 0. 35Цель изобретения - повышение выхода и активности целевого продукта с сохранением антигенной структуры.Поставленная цель достигается тем, что согласно способу выделения лицо зима из молозива, включающему обеэжиривание исходного сырья с послецующим центрифугированием и очистку целевого продукта аффинной хроматографией на деэаминированном хитине, перед выделением целевого продукта к обезжиренному молозиву добавляют 0,1-0,2-,ный раствор сычужного Фермента с активностью 100.000+500 усл.ед. в 1 г сухого вещества в соотношении соответственно 13-4 ):(1-2 ); далее инкубируют полученную смесь в течение 2-3 ч при 36-38 С, а центрифугирование прооводят при 1000-2000 д.Способ осуществляют следующим образом.К 3-4 частям обезжиренного молозива добавляют 1-2 части 0,1-0,2-ного раствора сычужного фермента с активностью не ниже 100.000 ед. с последуюцими термостатированием при 36-38 С 2-3 ч и центрифугированием 15-20 мин при 2000-3000 об/мин. Далее выделяют лиэоцим на колонке с дезаминированным хитином, для чего сыворотку молозива наносят на колонку, наполненную 65 деэаминированным хитином крабов с размером частиц 175-250 мк и уравновешенную фосфатным буфером рН 8,0.В этих условиях лизоцим полностью сорбируется из хитина и задерживаетсяв колонке, в то время как примесивымг.гваются. Затем через колонку пропускают фосфатный буфер рН 8,0, отмыьая от оставшихся примесей, лизоцимпри этом остается на дезаминированном хитине Затем через колонку пропускают 0,1-0,2 М раствор уксуснойкислоты, который смывает отмытый отпосторонних веществ лиэоцим с хитина. Скорость протекания раствора через колонку - 1 капля/с.1041934 Составитель А. Яковлев.Редактор А. Маковская Техред И.Метелева Корректор А.Дзятко Заказ 7119/45 Тираж 873Подписное ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий 113035, Москва, )Х, Раушская наб., д, 4/5Филиал ППП "Патент", г. Ужгород, ул. Проектная, 4 П р и м е р 2. Берут 120 мл натив- ного молозива, центрифугируют 20 мин при 3000 об/мин., Верхний слой жира удаляют. К обезжиренному молозиву добавляют 25 мл 0,2-ного раствора сычужного фермента с активностью 5 100,000 ед. Смесь помещают в термоостат при 37 С на 2 ч, Створоженное молозиво центрифугируют 20 мин при3000 об/мин. Осадок удаляют, а 25 мл сыворотки молозива с литической ак тивностью лиэоцима 138,32 ед. акт/мп пропускают через колонку размером 2 х х 40 см, наполненную дезаминированным хитином и предварительно уравновешенную фосфатным буфером рН 8,0. После 15 этого колонку промывают тем же буфером, контролируя отмывку посторонних веществ измерением оптической плотности раствора при длине волны 280 ммк на приборе СФ, а отсутствие лизоци- О ма в отмывном растворе - по измерению20 литической активности фермента. Через 200 мл оптическая плотность выходящего из, колонки Раствора становитсяравной нулю. Затем через колонку про пускают 0,2 М раствор уксусной кислоты, смывая лизоцим. Контроль за вы- . ходом лизоцима ведут так же, как контроль за отмывкой. Выход лизоцима на-. блюдают с 30 мл пропускания уксусной кислоты и заканчивают на 45 мл. Ско рость протекания растворов в колонкеравна 1 капле в секунду. Контроль эа полнотой извлечения лизоцима из сыворотки проводят путем измерения литической активности лиэоцима мето дом диффузии в агар. Весь лизоцим, содержащийся в исходном сырье, извлекают при промывании колонки 0,2 М . раствором уксусной кислоты в объеме 15 мл с литической активностью 40 319,9 ед. акт/мл.П р и м е р 3. Берут 120 мл натив- ного молозива, центрифугируют 15 мин при 3000 об/мин, Верхний слой жира 4удаляют, К обезжиренному молозиву добавляют 25 мл 0,1-ного раствора сычукного фермента с активностью 100.500 ед. Смесь помещают в термостат при 38 С на 3 ч, Створокенное молозиво центрифугируют 15 .мин при 3000 об/мин. Осадок удаляют, а 25 мл надосадочной жидкости с литической активностью лизоцима 432625 ед.акт/мл пропускают через колонку размером 2 х 4х 40 см, наполненную дезаминирован ным хитином и предварительно уравновешенную фосфатным буфером рН 8,0. После этого колонку промывают тем же буфером, контролируя отмывку посторонних веществ измерением оптической плотности раствора при длине волны 280 ммк на СФ-,16, а отсутствие лизоцима в отмывном растворе - по измерению литической активности фермента. Через 2550 мл оптическая плотность выходящего из колонки раствора становится равной нулю. Затем через колонку пропускают 0,1 М раствор уксусной кислоты, смывая лизоцим. Контроль за выходом лиэоцима ведут так же, как контроль эа отмывкой, Выход лизоцима наблюдается с 45 мл пропускания уксусной кислоты и заканчивается на 63 мл, Скорость протекания растворов в колонке - 1 капля/с. Контроль эа полнотой извлечения лиэоцима иэ сыворотки проводят путем измерения литической активности лизоцима .методом диффузии и агар. Весь лизоцим, содержащийся в исходном сырье, извлекают при промывании колонки О," М раствором уксусной кислоты в объеме 18 мл с литической активностью 432,37 ед, акт/мл,Предлагаемый способ по сравнению с известным позволяет увеличить удельную активность лиэоцима в 250 раз с сохранениел его антигенной структуры при 100-ном от исходного выхода целевого продукта.