Способ получения фермента, окисляющего холестерин до перекиси водорода и холестенона

ОП ИСАНИЕИЗОБРЕТЕН ИЯК ПАУЕеееУ Союз Советских Социалистических Республик, Кл. 12 Э 13/1 32) 17,05,72,33) ФРГ 23) Приорите ооударетвенныи иомит Совета е 1 инистров ССС оо делам нзооретенийн отнритийллетень 46 сания 10017 бликовани 5) Да ИностранцыВольфганг Грубер, Ханси Михаель Нельбек-ХохштКлаус Бокан, ГюнтерИоханнао Грамзалль и Гюн льрих Берхмайе ттер (Австрия) Хольц,ер Ланг (ФРГ)(72) Авторы изобретен Иностранная фирма Беринг Маннхайм Гм71) Заявитель ОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ФЕРМЕНТА, ОКИСЛЯЮЩЕГО ХОЛЕСТЕРИН ДО ПЕРЕКИСИ ВОДОРОДА И ХОЛЕСТЕНОНА1-3, пренмущесного раствора Изобретение относится к области микробиологии.Способ получения фермента, окнсляющего холестерин до переки"и водорода и холестенона заключается в том, что биомассу микроорганизмов-продуцентов экстрагируют буфером, содержащим неионогенное поверхностно-активное вещест" во и выделяют целевой прод,кт из бесклеточного экстракта, кроме того в ка честве продуцента используют культуру Ргоасцпощусеэ егуОдохюбв штамм КВС 9158. или АТСС 17895,или АТСС 42 77,или культуру )еосогна 1 огвив штамм АТСС 14811,Микроорганизмы разлагают, раство ряют и извлекают с помощью буферного раствора, содержащего неионогенное поверхностно-активное средство.Предпочитаеьюми неионогенными поверхностно-активными средствами явля) ются алкиларилэтиленглноли и аддукты окисей полиэтилена и полипропилена, в особенност их сложные эфиры. Принципиальная концентрация поверхностно-активного средства в используемом для 28 разложения (растворения) и для экстрагирования в буферном растворе зависит от применяемого поверхностно-активного средства и может определяться с помощью предварительных испытаний. При-ЗО годны концентрации 0,0 твенно 0,1-1%, РН буфер5-9, предпочтительно 6-8.Особенно хорошие результаты получаются, если микроорганизм перед растворением и перед экстракцией в присут-. ствии поверхностно-активного средства промывают смесью бутанола и воды.Полученный экстракт, содержащий в растворе Фермент, очищают на нонообменнике.В качестве ионообменника применяют анионообменные смолы, в особенности слабобазисные сорта, предпочтительными ионообменниками являются и те, которые несут диэтиламиноэтаноловую группу.Вымывание ионообменника осуществляют 0,01-0,2 М буферным раствором с рН 5-9. Концентрация поверхностно-активного средства преимущественно 0,0- 2.Предпочтительно применение 0,03- 0,1 М фосфатного буферного раствора с содержанием 0,2-0,7 поверхностно- активного неионогенного средства.Из полученного таким путем элюата Фермент осаждают с помощью солей или органических растворителей, например сульфата аммония, метанола и других,для повторного растворения,осажденного Фермента применяют.,буферныйраствор, который содержит небольшоеколичество поверхностно-активногосредства 5Фермент, полученный после ионооб)аенного вымывания можно испольэоватьнепосредственно для количественного, определения холестерина согласно уравнениюколесерин (БН) + О+холестенон+Н ОАктивность фермейта и эффективность. предлагаемого способа определяют благодаря тому, что образующуюся ФракциюН Оззамеряют по известным методам определения НО)6Микроорганизмы ныращивают на средейэ минеральных солей, содержащих пеплов, и как только достигают логарифМической фазы роста, добавляют водную эмульсию, которую,изготавливаютпутем мокрого размола водной суспенэни холестерина и последующей стерилизацией при высокой температуре.Таким ббразом удается достичь 100%использования холестерина н течение 25односуточного выращивания культурымикроорганизма) прн выходе 1-2 г чистой субстанции сухих клеток. Вульоне культурой добавляют в таком количестве, что задают 1-20 г холестерина 30Ма каждыйлитр н период роста. Загрузку осуществляют порциями по мере росса микроорганизмов,Небольшое количество холестеринадобавляют в бульон с культурой еще н З 5начале роста, т,е. перед достижениемлогарифмической Фазы роста,В качестве питательной среды исполь.эуют водный. раствор, содержащий, вес.%:0,1-2 пептона, 0,01.-0,2 К НРО 4, 0,05- 46Н 4 НРО 4, 0,05-1 гентагидрата сульфата магния, который содержит следыхлорида железа и хлорида кальция,рН 6-9. Начальная загрузка холестернна составляет 0,01-0,1%.Удельное содержание Фермента до7 Р/г сухой массы бактерий и 1-3,5 гсухой массы бактерий на каждый литрпитательной среды.удельное содержание микроорганизИов в Ферменте удается. Увеличить благодаря тому, что микроорганизм сна"чала выращивают на ацетате и затем нахолестерине н качестве единственногоисточника углерода.Так, например при выращивании мик" ффроорганиэмон на среде иэ минеральныхсолей с указанным выше составом, нопри замене яептона ацетатом вколичестве 0,5 вес.% до начала добавления холестериноной эмульсии.достнга- Фют повышения удельной активности до24 у/г сухой массы, одновременно увеличивается содержание сухой массы до6,5-г/л. Значительное повышение содержания сухой массы и активности до- бй тигают благодаря тому, что к воднойуспенэии холестерина добавляют в качестне змульгатора небольшое количество 0,02-1, предпочтительно 0,05-0,3вес.% дрожжевого экстракта,Предпочтительная питательная средасостоит иэ водного раствора с содержанием 0,1-2 вес.% ацетата (ацетата аммония), 0,01-0,2 вес,% К 4 НРО, 0,051 вес,.% ННРО, 0,05-0,1 вес.% сульфата магния в качестве гептагидрата,следов хлорида железа и хлорида кальция с величиной рН 6-9. При достижении логарифмической Тазы роста ацетатзаменяют хо.ес 1 ерином. ЧтобырН н период выращивания останалась постоянной, непрерывно или порциями загружают кислоту. Во время Фаэ ростас помощью ацетата и качестве источника углерода применяют уксусную кислоту, как только переходят на холестерин, уксусную кислоту заменяют минеральной кислотой. В этой второй стадии роста применяют соляную кислотудля регулирования величины рН. Приэтом достигают активность до 30 у /гсухой массы.Н р и м е Р 1, 2 л питательнойсреды, состоящей нз 0,5 вес.% казеиноного пептона, 0,05 нес.% К НРЦ0,2 нес.% Н, Н,РО 0,02 вес.% гептагидрата сульфата магния, следов хлорида железа и хлорида кальция з водопроводной воде и с помощью КОН регулируют нелччину рБ 7,5, задевают вкачаннщейся колбе с 200 мл хорошо выросшей предварительной культурйРгоос 11 по глсеь е 1 Ъо ра 31 зИВС 9158 и сильно нентилируют на магнитной мешалке. С началом логарифмической Фазы роста, определяемой по возникающему увеличению помутнения, в период дальнейшего выращивания периодически загружают приготовленную с помощью мокрого размола, стерилизованнуюхолестериноную,эмульсию, таким образой,что в течение 20 ч в колбу загружают10 г холестерина. Через 5 ч после по"следней загрузки клеточную массу собирают путем центрифугирования, ПолуЧают 4 г сухой массы бактерий. Послерасщепления с помощью ультразвука по"лучают 3 у /г Фермента.П р и м е р 2. В сосуде культивируют 15 л описанной в примере 1 среды вместе с 0,5 л хорошо выращенной предварительной культурой Роас 11 потпчсээ еййго.Р 11 э АТСС 17895 при сильной аэрации.Ссамого начала загружают 0,05% холестерина.С началом логарифмического роста непрерывно загружают стерилиэовантную холестериновую суспенэию в течениедальнейшего выращивания, так что нФерментер загружают в целом 50 г холестернна эа 15 ч выращивания. Приэтом получают бактернальную массу в40 г, Иэ бактериальной массы посредством расщепления (разложения) ультразвуком получают 7,1 Ч /г фермента.П р и м е р 3. Как описано в примере 2, в рабочем объеме 60 л культивируют бактерии Ртоск 1 цотусез лгуЦцороЕв(ВС 9158). Приблизительно через 25 чвводят свежую питательную среду в со"суд для выращивания бактерий и забирают раствор с выросшей культурой изэтого сосудаОдновременно н ферментатор вводятхолестериновую суспензию; за 1 ч загружают около 3 г холестерина. Такимобразом при непрерывном выращиванииполучают 1,2-1,5 г/л бактериальнойсухой массы с одинаковой удельной активностью,П р и м е р 4. В ферментаторе емкостью 20 л к 15 л питательной среды,состоящей иэ 0,5 вес, ацетата аммония, 0,05 вес, вторичного фосфатакалия, 0,2 вес. первичного Фосфатааммония, 0,02 вес. гептагидрата сульфата магния и следон хлорида железа и кальция в водопроводной воде, засеивают 0,5 л хорошо выращенной предварительной культуры бактерий РгооЖткитуез ефйгоройа ИВС 9158 и культивируют при 0 15 Ю сильной аэрации.Величину РИ культуры поддерживаютпостоянной посредством текущей загруз- ЗОки 20-ной уксусной кислоты до "концентрации биомассы около 1,5 г/л. Последостижения этого содержания стерилиэованную суспензию непрерывно загружаютв ходе дальнейшего выращивания таким 3 яобразом, что в целом в Ферментатор эагружают 30 г холестерина в течение 20 ч выращивания культуры. Холестери" новая суспензия содержит 0,1-0,2 дрожжевого экстракта. Затем для нейтрализации культуры вместо уксусной кислоты используют разбавленную соляПосле завершения культивирования биомассу с помощью цеитрифугироваиия отделяют от раствора культуры.П р и и е р 5. При двухступенчатомнепрерывном способе выращивания комбинируют два Ферментатора с рабочими объемами 15 л для первой и 70 л для второй ступени таким образом, что при часовом протоке 4 л, описанной в примере 1 питательной среды получается доля протока 0,25-0,30 для первой ступени и 0,055-0,065 для второй.К началу культивирования вторую стуПень засевают хорошо ьыращенной предварительной культурой бактерий Ргас-Ьлащусез в-у 1)пора(1 з, АТОС 17895 в количестве 1,5 л и вторую ступень засевают такой же предварительной культурой в количестве 0,5 л при сильной, аэрации обеих ступеней, причем первую ступень нейтрализуют с помощью уксусной кислоты, а вторую ступень с поющью соляной кислоты. Одновременно во вторую ступень включают систему притока (4 л питательной среды/час), Величину РН выдерживают 7-7,5. Таким образом за 1 ч получают 4 л бульона с культурой при 7 г/л при активности 30 /г сухой массы. Раствор культуры собирают в охлажденном резернуаре и бактериальную массу выделяют из него на непрерывно действующей центрифуге. Для регулирования виличины РН в первой ступени на каждый час требуется приблизительно 10 г 100-ной уксусной кислоты.П р и м е р 6. 40 мл суспензии с бактериями ЯосаМ(а егуЬгороЬз (около 10 г сухой массы)примешивают к 40 мл и -бутанола и в течение нескольких минут перемешивают при комнатной температуре. Смесь центрифугируют и Из нее удаляют бутанол и лишнюю водную Фазу. Осадок снова примешинают к 40 мл воды и после изготовления гомогенной суспенэии клеток снова при- . мешивают к 40 мл и -бутанола, нескоЛько минут перемешивают и.центрифугиру . ют. Осадок суспендируют в 40 мл 0,01 .И буферного раствора фосфата (РН 7,0), к которому добавляют 0,3 неионогенного поверхностно-активного средства (алкиларилполизтиленгликоль) и перемешивают в течение 30 мин при комнатной температуре, Затем центрифугируют и осадок извлекают, Экстракт содержит около 120 ед. фермента с удельной активностью 3 ед/мл протеина.Этот экстракт примешивают к твердому сульфату аммония до концентрации 1,3 И и сульфате аммония при температуре 0 С, затем суспензию центри- фугируют, осадок собирают на основе оченидной липофильной доли на поверх ности раствора. СпЕченный осадок филЬтруют, рас"гноряют с 0,01 М буферного раствора фосфата, рН 7 и при температуре 0 С подвергают диализу по отношению к тому же буферному раствору,Диализированный раствор пропускают через уравновешенную с помощью 0,01 М Фосфатного буферного раствора колонну товарного анионита с диэтиламинозтаноловыми гр ппами на основе декстранаПри этом фермент адсорбируется. После промывки колонны с помощью того же буферного раствора про изводят последовательно промывку растворами с 0,5, 2 и 5 укаэанного выт ше поверхностно-активного средства в воде. При этом вымываются большие количества загрязнений.Затем последовательно осуществляют промывку с помощью 0,1 М фосфатного буферного раствора, РН - 7;0,05 М фосфатного буферного раствоРа, рН - 7, 0,2 М фосфатного буферного раствора, РН 7, и 0,5 М фосфатного буферного раствора РН 7.584801 Формула изобретения Составитель С, МалютинаТехред М.Левицкая Корректор Л.Небола Редактор Н. Потапова Заказ 4628/721 Тираж 541 Подписное ЦИНИПИ Государственного комитета Совета Министров СССР по делам изобретений и открытий 113035, Москва Ж, Раушская наб., д, 4/5Филиал ППП фПатент, г. ужгород, ул, Проектная, 4 Затем снова производят промывку с помощью 0,05 М Фосфатного буферного раствора (рН 7) и фермент с 0,05 М фосфатного раствора, к которому добавляют 0,05 поверхностно-активного сред" 8 ства, вымывается.В элюате находятся около 80 адсорбированной на колонне ферментной активности в ферменте с удельной активностью 25-30 У /мг протеина.10П р и м е р 7. Повторно осуществляют способ по примеру б, но промывку водой с бутанолом не производят. Таким образом, получают экстракт для высаживания сульфата аммония, который содержит около 120 ед. фермента с удельной активностью в 1 ед/мл протеина, Даль" нейшее обогащение известным способом приводит к получению продукта с удельной активностью 8-10 У /мг протеина.П р и м е р 8. повторяют способ по ф примеру б, но вымывание анионита осуществляют с помощью водного раствора,который содержит 5 такого же поверхностно-активного средства в растворенном состоянии. Фермент поглощается изанионита (анионообменной смоле) . 1. Способ получения фермента, скисляющего холестерин до перекиси водорода и холестенонао т л и ч а ю щ н йс я тем, что биомассу микроорганизмовпродуцентов экстрагируют буфером, со" держащим неионогеиное поверхностно-активное веще .тво и выделяют целевой продукт из бесклеточного экстракта. 2. Способ по п, 1, о т л и ч а ющ и й с я тем, что в качестве проду-, цента используют культуру Рюасйиощуоез мгуйгоройа штамм КВС 9158, или ОТСС 17895, или АТСС 4277, или культуру КосаМса 1 огтка штамм АТСС 14811,