Способ определения нейроцитотоксинов в сыворотке крови

где С - концентрация малонового диальдегида, нМ на 1 г ткани мозга,Р - показания спектрофотометра1 экстинкция );1,56 105- молярный коэффициент экстинкции для малонового диальдегида.Вычисляют разность в концентрации маловоного диальдегида между контрольной и опытной пробирками. Эта разность отражает интенсивность образования малонового диальдегида под ИзОбретение относится к медицине,а именно к неврологии и психиатрии,и может быть использовано при диагнос.тике нервно-психических заболеваний:шизофрении, маниакально-депрессивногопсихоза, реактивных состояний, рассеянного склероза и других.Известен способ 1,определения - нейротоксинов в сыворотке крови больных психическими заболеваниями путемвведения сыворотки экспериментальным. 10животным 1 п чиччо с последующим исследованием изменения ультраструктурымозга экспериментального животногонейроны гигантского ганглия улитки 1.Известен способ определения нейро цитотоксинов сыворотки крови, основанный на оценке ингибирующего влиянияиспытуемой сыворотки на субкомиссуральиый орган мозга, которое проявляется в уменьшении ширины клубочковой зоны коры надпочечников, заклю 20чающийся в том, что испытуемую сыворотку вводят в хвостовую вену экспериментальным животнью крысами, а через 24 ч забивают животное, извлекают надпочечники и проводят морфологическое исследование клубочковойэоны. При наличии в сыворотке нейроцитотоксиног происходит подавлениефункциональной активности субкомиссурального органа, который регулирует 30интенсивность секретообразовательных процессов в клубочковой зоне коры надпочечников. Следствием этогоявляется уменьшение гормонообразова- ния, проявляющееся при морфологичес ком .исследовании в уменьшении ширины клубочковой зоны коры надпочечников. Уменьшение ее ширины на 30-50 по сравнению с исходной свидетельствует о цитотоксических эффектах сыворотки исследуемого больного 2 3.Недостатками этого способа являются длительность выполнения, поскольку для получения конечного результата необходимо несколько дней: в первый день 45 берется кровь и вводится животному, во второй день животное забивают и извлекают надпочечники, в течение последующих дней подготавливают препарат для морфологического исследова ния: трудоемкость, большое число процедур, внутривенное введение сыворотки животному; забой животного, извлечение и препарирование надпочечника, подготовка и проведение гистологического исследования; большое количество крови, необходимое для анализа.Цель изобретения - ускорение способа.Указанная цель достигается тем, что согласно способу определения нейро цитотоксинов в сыворотке крови путем воздействия испытуемой сыворотки на мозг животного; гомогенат головного мозга экспериментального животного инкубирувт с испытуемой сывороткой,отделяют осадок и в супернатанте определяют концентрацию.яалонового диальдегида, по уменьшению его концентрации по сравнению с контролем определяют уровень нейроцитотоксинов,Способ осуществляют следующим образом.Крысу забивают декапитацией, извлекают мозг, взвешивают и растирают в фарфоровой ступке с 0,05 М трисбуфером рН 7,4 из расчета 30 мл буФЕра на 1 г мозга. Все операции проводят на холоду. Мозг взрослой крысы весит 1-1,5 г,что дает возможность приготовить 30-45 мл.гомогената/ количество которого достаточно для .выполнения 30-45 определений нейротропной активности.У больного из. вены берут 1,5-2 мл крови, обычным способом приготавливают сыворотку. Дпя определения достаточно 0,6 мл сыворотки.В стеклянную пробирку наливают 0,5 мл гомогената мозга, 0,3 мл сыворотки,0,1 мл комплемента морской свинки (сухой ампулированный комплемент разводят 20 мл Физиологического растворами, Эта пробирка является опыт ной, В другую пробирку,контрольную, наливают .0,5 мл гомогената мозга и инкубирувт параллельно с опытной на водяной бане при 37 С в течение 2 ч, периодически встряхивая. По истечении срока инкубации в пробирки добавляют по 0,1 мл 100-ной трихлоруксусной кислоты для остановки реакции. В контрольную пробирку наливают затем 0,3 мл сыворотки и 0,1 млкомплементаВ обеих пробирках определяют концентрацию малонового диальдегидано реакции с тиобарбитуровой кислотой, Для этого в каждую пробирку приливают 1 мл насыщенного раствора тиобарбитуровой кислотыИнтенсивность образующейся окраски измеряют на спектрофотометре при длине волны 535 нм или на Фотоэлектроколориметре с зеленым светофильтром. Выполнение одним лаборантом 30-60 опре. делений занимает б ч рабочего времени,Количество образовавшегося малоновс го диальдегида вычисляют по Формуленая проба 194,3 нМ/г мозга, опытная проба 68,6 нМ на 1 г мозга. Нейроцитотоксины в испытуемой сыворотке отсутствуют, что является характерным для сыворотки здоровых людей,П р и м е р 2. Больной С. поступил в клинику психиатрии Ростовского медицинского института 11.03.81 с диагнозом: шизофрения. Номер истории болезни 1938/72. Забор крови произведен из локтевой вены в количестве 2 мл. Сыворотка получена обыч.,ным способом. При исследовании были получены следующие результаты концентрации, нМ малонового. диальдегида на 1 г мозга: контрольная проба 158,7; опытная - 111,1, разность между ними составляет 47,6 нМ малонового диальдегида на 1 г мозга, Полученные ,значения, характерны для шизофрении, Разность между контрольной и опытной пробами в данном случае меньше, чем эта же разность у здоровых людей, Она вычисляется в соответствии с пропорцией: 127 нМ/г мозга 10047,6 нМ/г мозга х откуда х = 38,2 ( разность в концентрации малонового диальдегида между контрольной и опытной пробами для испытуемой сыворотки по сравнению с таковой для сыворотки здоровых людей, принятой за 100).Эта величина снижена по сравнению со здоровыми людьми на 61,8.Значение нейротропной активности ( 61,8 ) характерно для шизофрении.П р и м е р 3. Больная С поступила в клинику нейрохирургии Ростовского медицинского института 30,04.81 с диагнозом: рассеянный склероз, церебро-спинальная форма. Номер истории болезни 3297/518. Больна с 1976 года, Забор крови произведен из локтевой вены в количестве 2 мл. Сыворотка получена обычным способом, При исследовании были получены следующие результаты концентрации, нИ малонового диальдегида на 1 г мозга: контрольная проба 143,0; опытная проба 76,2, разность между ними составляет 66,8 нМ малонового диальдегида на 1 г мозга. Полученные значения характерны для рассеянного склероза. Разность между контрольной и опытной пробами в данном случае меньше, чем эта же разность у здоровых людей, Она рассчитывается аналогично примеру 2 и составляет 46;6.Значение нейротропной активности ( 46,6) характерно для рассеянного склероза.П р и м е р 4. Больная 3. поступи. ла в клинику психиатрии Ростовского медицинского института 02.04. 81 с диагнозом: маниакально-депрессивный психоз. Номер истории болезни влиянием испытуемой сыворотки и характеризует степень содержания нейроцитотоксинов в испытуемой сыворотке.Сыворотка здоровых людей значительно угнетает процессы перекисногоокисления липидов при инкубации с.5гомогенатами мозга. Концентрациямалонового диэйьдегида ь этом случае ниже в опытной пробе, чем в контрольной. При этом разность междуконтрольной и опытной пробами состав Оляет 127.0+1,32 нМ малонового диальдегида на 1 г ткани мозга с колебаниями 121-133 нМ,При исследовании сывороток кровибольных установили, что количество 15малонового диальдегида, образующегосяпод влиянием сыворотки (разность между контрольной и опытной пробами ),составляет нМ малонового диальдегидана 1 г мозга при: шизофрении 55,3++2,29(п=12, колебания 57,1-85,7), рассеянном склерозе 68,3+4,28 (и =38,колебания 22,2-85,7 ; доброкачественныхопухолях мозга 105,7+3,48(п =8, коле-бания 95,2-120,6); сирингомиелии111,1+7,99(п =3, колебания 101,6-127,0)ЗОостеохондрозе шейного отдела позвоночника 120,1+8,0(о=3, колебания107,9-127,0); глазных заболеваниях127,3+5,13(п =7, колебания 105,0-142,9инфекционном гепатите 127,0+5,0(п =5, 35колебания 114,0-133,3 ), фТаким образом, наиболее низкиезначения концентрации малонового диальдегида обнаружены при исследовании сывороток больных шизоФренией, 40затем рассеянным склерозом,маниакально-депрессивным психозом, тогда какпри других нервно-психических заболеваниях значения достоверно выше.По сравнению со здоровыми людьмиразность в концентрации малоновогодиальдегида между контрольной и опытной пробами при заболеваниях нервнойсистемы уменьшается на , при;шизофрении 56,4 (колебания 39,4-82,3); пограничных состояниях 14 ( колебания 10-526:5); маниакально-депрессивном психозе 43,5 (колебания 34,0-54,0 ); рассеянном склерозе 45,7 (колебания 31882,3 );,доброкачественных опухоляхмозга 16,5 (колебания 4,5-24,3); 55сирингомиелии 11,9 (колебания 0-19,1)остеохондрозе 5,3 (колебания 0-16),П р и м е р 1. Донор А. Ростовской областной станции переливаниякрови. Забор крови произвели из лок- бОтевой вены в количестве 2 мл. Сыворотку получили сбычным способом. Приисследовании сыворотки крови были получены следующие величины концентрации малонового диальдегида; контроль1041933 Составитель С. КотелевцевРедактор Л. Алексеенко Техред Т,Фанта Корректор А,Дэятко Заказ 7119/45 Тираж 873 Подписное ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий 113035 Москвар Ж 35 Раушская наб;, д., 4/5Филиал. ППП "Патент", г. Ужгород, ул. Проектная, 4 2503736. Забор крови произведен иэ лрвтевой вены в количестве 2 мл. Сыворотка полученаобычным способом. При исследовании получены следую-. щие результаты концентрации, нМ малонового диальдегида на 1 г мозга, контрольная пр,эба 190.,5; опытная проба 130,2, разность между ними составляет 60,3 нМ малонового диальдегида на 1 г мозга, Полученные значения характерны для маниакально-депрессивного психоза, Разность между контрольной и опытной пробами в данном случае меньше, чем эта же разность у здоровьи людей. Она определяется аналогично примеру 2 и составляет 51,9.Значение нейротропной активности ( 51,Ь ) характерно для маниакально- депрессивного психоза.П р и м е р 5. Больная, Б. поступила в клинику нервных болезней и нейрохирургии Ростовского медицинского института 12,03.81 с диагнозом: остеохондроз с компрессией корешковой артерии. Номер истории болезни 1956. Забор крови произведен иэ локтевой вены в количестве 2 мп. Сыворотка получена обычным способом. При исследовании были получены следующие результаты концентрацни, нМ малонавого диальдегида 1 на 1 г мозга: контрольная проба206,4, опытная проба 98,4, разностьмежду ними составляет 108,0 нм малонового диальдегида на,1 г мозга.Разность между, контрольной и опытнойпробами в данном случае меньше, чемэта же разность у здоровых людей.Она определяется аналогично примеру 2 и составляет 15.Значение нейротропной,активности 10 (15) свидетельствует от отсутствиинейроцитотоксинов в данной сыворотке.Использование предлагаемого способа позволит в, экспериментеопределить степень нейросенсибилизациипри моделировании различных иммунопатологических процессов нервнойсистемы и при различных лечебныхвоздействиях. В клинике применение 20 предлагаемого способа дает возможность в течение короткого промежуткавремени (3-6 ч)уточнить диагноз.шизофрении, рассеянного склероза,маниакально-депрессивного психоза 25 доброкачественных опухолей мозга,реактивных состояний, психопатии,сирингомиелии, остеохондроза, атакже определить степень нейросенсибилиэаций конкретного больнОго, что 30,позволит своевременно назначить правильное лечение.