Способ получения альдолазы из скелетной мышцы человека

(19) (11) б 4 А 61 К 35/34 ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССРПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИИ ВСИОВЗНЬЯ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ 3 ":Б К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ яилио тки(71) Куйбышевский медицинский институт им. Д.И.Ульянова(56) Гулый М.Ф., Дворжикова П.Д., Коломийченко М.А Понадюк Е.Я. ь 1 етод фракционирования и кристаллиэа": ции мьвечных белков. Вопросы биохимии мышц, Киев, 1954, 244-258.А.1)вцику Я.Мпц 1 с апд Т.Вагапочз 1 се "РцгН 3.сагыз.оп апй ртореттез оК Ььшап Мцзс 1 е А 1 йо 1 азе" А 1 йа ВдосЬдшдса ро 1 Ыдса" Л 3, 1974, 21 р,237- 245.(54)(57) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АЛЬДОЛАЗЫ ИЗ СКЕЛЕТНОИ МЫШЦЫ ЧЕЛОВЕКА путем раэмельчения ткани, экстрагировання раствора белков, добавления к полученному раствору сульфата аммония,отделения балластных белков с последующей кристаллизацией целевогопродукта, о т л и ч а ю щ и й с ятем, что, с целью ускорения способа,экстракцию пробы проводят двузамещенным раствором КНР 04 в соотношении1;2 в течение 60 - 80 мин, далееэкстракт отделяют от плотной части,добавляют сульфат аммония до степенинасыщения 0,45 по объему, центрифугируют при 6000 об/мин в течение 20 -30 мин, к полученному супернатантудобавляют сульфат аммония до насыщения. 0,55, снова центрифугируют прие12000 об/мин в течение 10 - 15 мин,осадок растворяют в 0,03 И раствора ,рвКНРО, добавляют сульфат аммония до %ааврН 6,0 - 6,2 и кристаллизацию целевого продукта ведут на холоде, 11022Изобретение относится к биологиии может быть использовано в энзимологии и в медицине для изучения заболеваний на молекулярном уровне.1 с;Известен способ получения альдолазы методом фракционного осаждениясульфатом аммония из скелетной мышцыкролика,Однако, этот способ выделения Фермента не позволяет получить альдолазув кристаллически чистом виде из мышцы человека.Известен также способ полученияальдолазы из скелетной мышцы человека путем размельчения ткани, экстрагирования раствора белков, добавления к полученному раствору сульфатааммония, отделения балластных белковс последующей кристаллизацией целевого продукта,Однако известный способ длителен.Целью изобретения является ускорение способа,Для достижения этой цели при осуществлении способа получения альдолазы из скелетной мышцы человека путем размельчения ткани, экстрагирования раствора белков, добавления кполученному раствору сульфата аммо- ЗОния, отделения балластных белков споследующей кристаллизацией целевогопродукта, отличительной особенностьюявляется то, что зкстракцию пробыпроводят двузамещенным растворомКНРО в соотношении 1:2 в течение60 - 80 мин, далее, экстракт отделяют от плотной части, добавляют сульфат аммония до степени насыщения0,45 по объему, центрифугируют при дб6000 об/мин в течение 20-30.мин, кполученному супернатанту добавляютсульфат аммония до насыщения 0,55,снова центрифугируют при 12000 об/минв течение 10-15 мин, осадок раство;ряют в 0,03 М растворе КНРО, добавляют сульфат аммония до рН 6,0 - 6,2и кристаллизацию целевого продуктаведут на холоде.Способ осуществляют следующим об- у 1разом.1 э т а и. Для выделения альдолазы берут 500 г мышечной ткани с бедра умершего, с момента смерти которого прошло не более 24 ч. Мышцы хорошо охлаждают с помощью льда, очищают от жировой, соединительной ткани, пропускают дважды через охлажденную мясорубку. Полученный Фарш 542 2взвешивают и смешивают с двукратным объемом охлажденного раствора 0,03 М КНРО. Экстрагируют 60 мин при периодическом помешивании стеклянной палочкой при температуре 2 С. Через 60 мин экстракции плотный остаток мышц отжимают через ткань, отбрасывают, Измеряют объем экстракта.К полученному экстракту добавляют растертый порошок сульфата аммония из расчета 32,4 г на каждые 100 мл, что составляет 0,45 насыщения. Порошок сульфата аммония добавляют не-большими порциями, медленно перемешивают, не взбивая пены, После полного растворения сульфата аммония через 15 мин стояния на холоде образовавшийся осадок балластных белков отделяют центрифугированием в рефрижераторной центрифуге при 6000 об/мин в течение 30 мин или фильтрованием через складчатый фильтр.11 э т а п. К прозрачному центрифугату или Фильтрату добавляют еще сульфат аммония из расчета 7,2 г на 100 мл, повышая тем самым насыщение до 0,55 (Фракц. 0,55). При помешивании стеклянной палочкой растворяют добавленную соль и через 15 мин стояния на холоде центрифугируют в реФрижераторной центрифуге при 10000 об/мин в течение 15 мин. Центрифугат отбрасывают. Плотный осадок, содержащий значительное количество альдолазы, собирают. В хорошо охлажденные пробирки к осадку, полученному из 500 г мьппц, прибавляют 15- 20 мл 0,03 М К НРО, Первой порцией растворяют осадок в первой пробирке, Растворив, переливают во вторую пробирку и т.д. Второй порцией омывают белок в каждой пробирке и объединяют растворы в последней, перемешивая стеклянной палочкой. При растворении осадка указанным объемом 0,03 М раствором КНРО раствор может быть прозрачным или слегка ополесцировать. Такой раствор пропускают через ватный Фильтр, смоченный 0,03 М раствором КНРО. Это позволяет избавиться от пузырьков воздуха и загрязнений. К полученному раствору добавляют мелкодисперсный сульфат аммония, тщательно перемешивая, до появления слегка заметной мути, дающей при перемешивании стеклянной палочкой шелковистость. Использование 0,03 М раствора К НРО для растворения осадРедактор Н.Сильнягина Техред И.Попович Корректор А.ТяскФ. Заказ 4451 Тирах 594 Подписное ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж, Раушская наб., д.4/5Производственно-полиграфическое предприятие,г.ужгород,ул.Проектная,4 3 10 ка и последующее Добавление сульфата аммония приводит к получению рН маточного раствора 6,0-6,2 при котором и происходит кристаллизация альдолазы, рН раствора проверяют потенциометрически.Если в результате фильтрования, через ватный фильтр, предварительно смоченный бидистиллированной водой, раствор становится прозрачным, то насыщениеследует повышать, прибавляя небольшими порциями сернокислый аммоний до появления шелковистости при медленном помешивании стеклянной палочкой. Оставляют в холодильнике для кристаллизации при температуре 3 С.Кристаллы альдолазы в виде гексагональных бипирамид появляются через 6 сут. без внесения затравки. При добавлении же затравки кристаллизация начинается через 12 ч. Процесс кристаллизации заканчивается на 9 сут.111 э т а п. Перекристаллиэация альдолазы. Осадок первичных кристаллов отделяют центрифугированием в, рефрижераторной центрифуге при 1 О 000 - 12 000 об/мин в течение 6 мин. Осадок растворяют в минимальном количестве 0,03 М раствора К НР 04 под контролем с помощью микроскопа. Раствор пропускают через смоченный 0,08 М раствором КНР 04. ватный 22542фильтр, освобождаясь тем самым от воэ.духа. Затем добавляют мелкодисперсный порошок сульфата аммония до появления слабой мути и шелковистости примедленном помешивании стеклянной паточкой. рН.маточного раствора, прикотором начинается кристаллизация,составляет 6,3. Кристаллизация может 10 протекать как при комнатной температуре, так и при стоянии на холоде.Первые кристаллы появляются черезсутки.Активность фермента возрастает 15 при перекристаллизации. Перекристаллизация обеспечивает получение гомогенных препаратов альдолазы, позволяет освободиться от миоглобина, дегидрогеназ и Других ферментов.20 Способ получения иэ ткани человека индивидуально чистого препаратаальдолазы - одного из ведущих Ферментов углеводного обмена, расширяетвозможности в теоритической энзимологии, а именно, могут быть охарактеризованы физико-химические свойства, структурно-функциональные особенности энэима из мышц человека, про слежены закономерности конформационной организации и каталитическойфункции и филогенезе, а в медицине - .возможность изучения заболеваний намолекулярном уровне.