Способ получения уридин-5 -монофосфата и урацила

ледоваи селекнизмов охина е,ры, минеральны е выделение из сти целевю щ и й совышения го оффе с 1 ег 1 а 1.,в каШтамм ИИгене я способа спользуют епез ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССРПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ ВТОРСИОМ,Ф СВИДЕТЕЛЬСТ(71) Всесоюзный научно-исстельский институт генетикиции промышленных микроорга(54)(57) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ УРИДИНМОНОФОСФАТА И УРАЦИЛА, включающий культивирование продуцирующих их микроорганизмов на питательной сред ержащеи источники углер та, ростовые фактсоли, и последующкультуральной жиддукта, о т л и чтем, что, с цельютивности и упрощечестве продуцентаВгечЬасегцш ащштика.10 Изобретение относится к микробиологической промышленности, в частности, к получению пиримидиновых произ 9 водных, а именно, уридин-монофосфата и урацила путем культивирования продуцирующих их микроорганизмов в азробных условиях на питательной среде способом прямой ферментации.Уридин-монофосфат (уридиновая кислота, 5 -УМФ, уридин-монофосфорная кислота УМФ) и урацил являются структурными компонентами рибонуклеиновых кислот, УМФ и урацил находят применение в пищевой промышленности, .фармакологии и служат исходными соединениями для синтеза антиканцерогенных и антибактериальных препаратов, 5 -УМФ и урацил используются также в качестве, реактивов в различных областях экспериментальной биологии.Известен способ, основанный на микробиологическом синтезе 5 -УМФ меФ тодом прямой ферментации с помощью актинамецентов определенных видов.Известен также способ получения урацила путем микробиологического синтеза с помощью салмонелл.Известные способы получения 5 -УМФ) методом прямой ферментации с помощью актиномицетов имеют следующие недостатки: максимальный выход 5-УМФ по патенту Японии низкий и составляет менее 1 г/л при продолжительности ферментации 168 ч на среде, содержащей в качестве источников углеродаФ глюкоэу, декстран, мальтозу; в качестве источников азота пептон, мочевину, нитраты.Получение урацила методом прямой ферментации с помощью культуры салмонелл также имеет недостатки: максимальный выход урацила низкий и составляет около 0,1 г/л при культивировании культуры на питательной среде, содержащей глюкозу, минеральные соли, казаминовые кислоты.Целью изобретения является разработка простого и эффективного микробиологического способа получения уриУдин-монофосфата и урацила методом прямой ферментации на основе использования отечественного бактериального штамма, В предлагаемом способе в качестве продуцента уридин-монофосфата и урацила используют мутантный штамм культуры ВгечдЬасгег 1 цш аввопдеп 1.я Вниигенетика, выделенный из штамма АТСС 6872 путем вве 15 20 25 30 35 40 45 БО 55 дения в геном исходного штамма рядапоследовательных мутаций, в .том числе устойчивость к высоким концентрациям 5-фторурацила. Штамм ВНИИгенетикахранится в Центральном музее промьппленных микроорганизмов Всесоюзного научно-исследовательского института генетики и селекции промьппленных микпроорганизмов и имеет регистрационный номер ЦМПМ В.Характеристика штамма Вг. апппопдяепдя ВНИИгенетика.Штамм ВНИИгенетика- грамположительная палочка, не образующая спор. На мясо-пептонном агаре и полт ноценной агаризованной среде Хоттингера образует колонии круглой формы, сплошные, с ровным краем, бледно- желтого цвета, диаметром 1-1,5 мм, Штрих на агаркзованной среде Хоттингера: после инкубации в течение 24 чаосов при 30 С наблюдается значительный рост. Штамм ВНИИгенетикаауксотрофный мутант, нуждающийся для роста в аденине. Максимальный выход 5 -УМФ при культивировании данного штамма составляет 3-4 г/л и урацила 2-4 г/л после 144 ч ферментации на синтетической среде, содержащей в качестве источника углерода глюкозу, источника азота - мочевину, источника ростбвых факторов - аденин, тиамин, пантотенат кальция, никатиновую кислоту. Кроме уридин-монофасфата и урацила, штамм ВНИИгенетиканакапливает до 2 г/л инозин -монофосфата и до 0,7 г/л гипо- . ксантина.Отличительной особенностью штамма ВНИИгенетикаявляется способность к интенсивному образованию красно- бурого пигмента после инкубацйи на полноценной питательной агариэованной среде в течение 48 ч. Данный признак удобен для тестирования, отбора, идентификации и хранения продуцента 5 -УМФ и урацила, что облегчает контроль за чистотой культуры при использовании предлагаемого способа.Способ осуществляется-следующим образом.юВ качестве продуцента уридин- монофосфата и урацила используют мутантный штамм Вг. апппопепдя ВНИИгенетикаКультуру, выращенную на агаризованной среде Хоттингера вО течение 24 ч при 28 - 30 С, перено923186 СоставительРедактор К. Сильнягина Техред М,Дидык Корректор М. Пожо Заказ 4450 Тираж 499 ПодписноеВНИИПИ Государственного комитета СССРпо делам изобретений и открытий113035, Москва, Ж, Раушская наб., д. 4/5 Производственно-полиграфическое предприятие, г. Ужгород, ул. Проектная, 4 сят в колбы с посевной средой и выращивают при постоянном перемешивании и аэрации в течение 20 - 24 чопри температуре 28 - 30 С. Затем посевной материал переносят в ферментационную среду.Процесс биосинтеза осуществляют в колбах на качалке (240-270 об/мин) при аэрации и перемешивании, соответствующих скорости растворения кислорода 2-3 г О /л ч при температурео28 - 30 С. Посевная и ферментационная среды содержат в качестве источника углерода - глюкозу, источника азота - мочевину, источника ростовых факторов - пептон, дрожжевой экстракт .аденин, тиамин, никатиновую кислоту, пантотенат кальЦия, а также минераль,ные соли (КН РОд, К НРО , М 8 БО, ГеБО 4, 2 пБО, МпС 1 , ИаОН).Способ, основанный на использовании предлагаемого штамма, обеспечивает выход уридин-монофосфата 3 - 4 г/л и урацила 2 - 4 г/л без добавления в среду предшественников данных соединений. Помимо этого, в среде накапливается инозиновой кислоты " 1,5-2 г/л и гипоксантина 0,5-0,7 г/л.Предлагаемый способ получения уридин-,5 -монофосфата и урацила методом прямой ферментации создает возможность организации промьппленного производства этих соединений на предприятиях микробиологической и медицинской промьппленности.Пример использования предполагаемого изобретения.Культуру штамма Вг. апппопд 8 еп.з ВНИИгенетика, выращенную в течение 24-48 ч при 28 - 30 С на агаризованной среде Хоттингера с добавлением аденина (5-10 мкг/мл), переносят на жидкую посевную среду следующего состава, : глюкоза - 2,0; пептон - 1,0;дрожжевой экстракт - 1,0; ИаС 1 - 0,25.Посевной материал выращивают в 5колбах емкостью 750 мл, содержащих100 мл среды, на качалке, делающей220 - 240 об/мин., в течение 20 -24 ч при 28 - 30 С. Инокулят передают в ферментационную среду в количестве 4 - бСостав ферментационной среды, Х:Раствор А Раствор БГлюкоза 10 К,НРО, 1,0КНгРО 1,0 МаОН 0,25М 8 БО 7 Н О 1,0 Н 0 - 100 ммСаС 1 г 2 НгО Оф 01РеБО 4 7 НгО 0001ЕпБО, 7 Н О 0,000120 МпС 1 г 4 НгО 0,001НгО 100 млПосле стерилизации растворы А и Бсливают и добавляют стерильно растворы до конечной концентрации,: моче вины - 0,6, тиамина - 0,0005, никатиновой кислоты - 0,0005, панотенатакальция - 0,001, аденина - 0,001;0,0015, рН среды 7,8-8,2.Процесс ферментации проводят в ЗО колбах Эрленмейера емкостью 750 мл,содержащих 30 мл среды, соответствующей скорости растворения кислорода2 - 3 г Ог/л ч при температуре 28, -30 С на качалке, делающей 220 -240 об/мин. После 144 ч ферментации 35в культуральной жидкости накапливается уридинмонофосфата 3-4 г/л, урацила 2-4 г/л, а также инозиновойкислотый 1,5 - 2,0 г/л и гипоксан тина 0,5 - 0,7 г/л.Выделение уридин-монофосфатаи урацила осуществляют известнымиспособами.