Способ получения изолимонной кислоты

Союз Советских Социапнсткческии РеснубпнкОП ИСАНИЕИЗОБРЕТЕНИЯК АВТОРСКОМУ СВИ ЕТЕЛЬСТВУ и 1842106(22) Заявлено 29.1179 (21) 2844702/28-13с присоединением заявки Йо(23) ПриоритетОпубликовано ЗСС 0681. Бюллетень Мо 24Дата опубликования описания 300681 51)М Клз С 12 Р 7/48 Государственный комитет СССР ио делам изобретений и открытий(72) Авторы изобретения Н.В, Шишканова, В.И. Илларионова, Т.В. Фино и А.Б. Лоэинов Заявитель охимии и физиологии микроорган АН СССР Институ ОТЫ 4) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ИЗОЛИМОННО конс о ее и сса О 1Изобретение относится к микробиологической промышленности, точнеек способу получения изолимонной кислоты, используемой в медицинскойи химической промышленностях,Изолимонная кислота используетсякак биохимический препарат, которыйзакупается за рубежом по очень высокой цене - 152.000 валютных руб.за 1 кг (фирма "5 е гча", США, 1975),Высокая стоимость продукта определяется сложностью методов его химического синтеза и последующего выделения,Известен способ получения изолимонной кислоты с помощью дрожжейНапзепц Ра 5 цЬре РР(сц Роза (ЗГО 3458)на питательной среде, содержащейв качестве источника углерода этиловый спирт 1Однако данный способ не обеспечивает достаточно высокого выхода изолимонной кислоты, ее выход от испопьзованного субстрата (60,0 г/л)составляет 23,3.Наиболее близким к предлагаемомуявляется способ получения изолимонной кислоты путем культивированияродуцента-штамма Сапада Р,гро Ру 704 на питательной среде, содержащей парафины в качестве источника углерода, азота, фосфора и минеральные соли в условиях аэрации 2)Цель изобретения - повышение выхода изолимонной кислоты.Указанная цель достигается тем, что в способе получения изолимонной кислоты, предусматривающем культивирование ее продуцента-штамма Сапаба Рро Рус 1 са 704 на питательной среде, содержащей источник углерода, азота, фосфора и минеральные соли в условиях аэрации, в качестве источника углерода используют зтанол .в концентрации 0,5-0,2. Эту центрацию этанола поддерживают путем его дробного введения в фермтационную среду.Такое ведение процесса позволяет изменить соотношение синтезируемых дрожжами лимонных кислот в сторону преимущественного накопления изолимонной кислоты, что значительно облегчает процессы выделения этой кислоты из ферментационного ра твора и последующей химочистки.В предлагаемом способе используют штамм 704 котсзрый в связи с ор 7 ганизацией Музея культур микро рганизмов в ИБФМ и передачей его в этотФормула изобретения Способ получения изолимоннойкислоты путем культивирования еепродуцента-штамма Сапд 1 да Ю ро ус 1- са 704 на питательной среде, содержащей источник углерода, азота,фосфора и минеральные соли в условиях аэрации, о т л и ч а ю щ и й с ятем, что, с целью повышения выхода55 целевого продукта, в качестве источника углерода используют этанолн концентрации 0,5-2,0.Источники информации,принятые во внимание при экопертизе1, Патент Англии Р 11997008кл. С 2 С, опублик. 1970.2. Авторское свидетельство СССР158 305187, КЛ. С 12 О 1/04, 1968,реж 528 ПодписноеУжгород, кл. Проектная,4 институт зарегистрирован как Сапд 1- да 1 роХуС 1 са ИБФМ У.П р и м е р 1. Дрожжи Сапс 11 да81 ро Еуг 1 са 704 (в коллекции института ИБФМ У) поддерживают на агаризованной минеральной среде Ридер,имеющей следующий состав, г/л:(МН 4) 504 3,0М 9505 7 Н 0МаС В 0,5Са (МОз ) 0,4КНП РО 4 1,0КТНРО 4 0,1Этиловый спирт 10,0Агар-агар 25,0Дрожжевой автолизат 2,0 млСмесь микроэлементов по Буркгольдеру 5 млСмесь микроэлементов по Буркгольдеру включает компоненты, мг/л среГе 0,05.Дрожжи выращивают на скошенномагаре в течение 3 сут при 28-30 С. Клетки смывают 5 мл стерильной водопроводной воды, и суспензию переносят в колбу объемом 750 мл, содержащую 50 мл питательной среды.Среда для выращивания посевного материала имеет следующий состав,г/л;(МН 4 )2 504 0 3М 9504 7 НО 0,7МаС 8 0,5Са (МОЗ)0,4КН 2 РО 4 1,0К 2 НРО 4 0,1Этиловый спирт 10,0Тиамин 500 мкгСмесь микроэлементов 5 млВыращивание проводят в течение48 ч на качалке (260 об/мин) при28-30 С. Полученную посевную куль 0туру переносят в новую партию колб со средой того же состава в количестве 5 от объема среды, Через 5 суткультивирования в среде накаплнвается 6,0 г изолимонной и 1,5 г лимонной кислоты. в 1 л, Выход изолимоннойкислоты составляет 60 от веса использованного субстрата, Соотношение лимонной и изолимонной кислот 1:4,П,р и м е р 2. Выращивание культуры Сапд 1 да 11 ро Гу 1 са ИБФМ У на с.кошенном агаре проводят, какопибано в примере 1. Клетки смывают 5 мл стерильной водопроводной воды,.и суспензию переносят в колбы на 750 мл с 50 мл питательнойсреды. Состав среды такой же, какв примере 1.Через 48 ч инкубации полученную посевную культуру переносят в новуюВНИИПИ Эаказ 4982/25 ТиФилиал ППППатент 88, г,партию колб с посевной средой того же состава, объем инокулюма 5 от объема среды,Вторую партию колб также помещают на качалку и культивируют при 528-30 С в течение 48 ч.о500 мл посевной культуры вносятв ферментационный аппарат с 4,5 л среды следующего состава, г/л:(вносится дробно)Соль Мора 3,5 мг Тиамин 500 мкг Смесь микроэлементов 10 мл2 О Во время ферментации рН средыподдерживают на уровне 6,0 путемвведения 10 МаОН, концентрациюкислорода поддерживают на уровне70-80 насыщения, температуру 28-30 оС.Концентрацию .этанола поддерживаютна уровне 5-20 г/л, Если она снижается, до 5 г/л, добавляют еще этанол,но так, чтобы его концентрация в среде не превышала 20 г/л,Через 138 ч культивирования всреде накапливается 66,0 г/л изолимонной кислоты (31,0 г/л лимоннойкислоты); выход кислоты составляет66,0 от веса использованного субстрата, Соотношение лимонной и изолимонной кислот 1;2.Таким образом, проведение фермен-тации по предлагаемому способу изменяет соотношение накапливаемых лимонных кислот в сторону преимущест 40 ненного накопления изолимонной, повышая ее выход, и тем самым облегчает процесс выделения кислоты изферментационного раствора и последующей химочистки.