Способ получения изолимонной кислоты

В.Шишкан Илларионова, Т.В.финогено И.Глазунова, и А.Б.Лозин 72) Авторы изобрете. с иологии крооргани) Заявител нститут биохимии СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ИЗОЛИИОННОЙ КИСЛО шенИзобретение относится к микробиологической промышленности, а именно .к способу получения изолимонной кислоты, используемой в раз" личных отраслях промышленности, на, пример медицинской, химической и др Изолимонная кислота метаболически близка лимонной кислоте и может найти применение в тех же областях ,народного хозяйства, где используется последняя, и производство кото рой не обеспечивает в достаточной степени потребности в ней (электррн ная, металлургическая, текстильная промышленность при производстве поверхностно-активных веществ, а также синтетических моющих средств вместо триполифосфатов натрия и калия, загрязняющих 4 всфором водные бассейны). Изолимонная кислота ис.-. пользуется как биохимический препарат в исследовательной работе, однако. стоимость ее очень высока,что значительно ограничивает облас.ти ее применения.. Известен способ получения изолимонной кислоты с использованием дрожжей вида СапЬЬа 1 ро 1 уйса, предусматривающий выращивание их на питательной среде при аэрации среды,содержащей источники углерода, азота,фосфора и минеральные соли 1. Наряду с изолимонной кислотой в ферментационной среде обнаруживают.и лимонную кислоту.Известен также способ производства,изолимонной кислоты при культивиро-вании дрожжей СапЬЬа Ьгнврй 1 ГО07 М в питательной среде с н-гексадеканом ( 60 г/л), получают 30,0 г/лиэолимонной кислоты с выходом 503 20 от внесенного алкана, лимонной кислоты в среде не обнаруживают21,Наиболее близким техническим ре"ием к описываемому по достигаемомуэффекту является способ получения2,0 мл 3 84978йзолимонной кислоты путем культивирования дрожжей вида Сапд 1 да 11 ро 1 у"11 са в условиях аэрации на питательной среде, содержащей этиловый спирт,в качестве единственного источникауглерода, азот, Фосфор и минеральныесоли 1 31.При культивировании дрожжейСапд 1 да 11 ро 1 уй 1 са на питательнойсреде, содержащей 2,03 этаноМ, вы фход изолимонной кислоты составляет60-66 от внесенного субстрата.Рассматриваемый способ не обеспечивает достаточно высокого выходаиэолимонной кислоты. 3Целью предлагаемого изобретенияявляется повышение выхода и концентрации иэолимонной кислоты.Поставленная цель достигается тем,что в способе получения изолимоннойкислоты, предусматривающем культиви"рование дрожжей вида Сапд 1 да 11 роу.Ф 1 са в условиях аэрации на питательной среде, содержащей источникиуглерода; азота, Фосфора и минераль зные соли, в питательную среду в процессе культивирования вносят ингибиторы изоцитрат-лиаэы в концентрации1,0-66,0 мм,При этом, в качестве ингибитора уиспользуют итаконат или оксалат натрия, а в качестве истоцника углерода - нормальные парафины или этанол.Использование предлагаемого способа позволит наладить производствоизолимонной кислоты иэ вышеперечисленных источников углерода с выходомэтого продукта, превышающим все известные достижения в этой области.Добавление к ферментационной средеитаконата или оксалата даже в небольших концентрациях сдвигает соотношение накапливаемых в растворе лимоннойи иэолимонной кислот в сторону изо"лимонной, что облегчает процессы выделения в химочистки последней. П р и м е р 1, Дрожжи СапдИа13 ро 1 уе 1 са ИБМФ У поддерживаютна агариэованной минеральной средеРидер с нормальными алканами (Г 1- фВС 9), имеющей следующий состав, г/л:Нормальные алканыСа- С 1 8,0(ЙН,у)504 3,0Ид 507 Н,О 0,7КаС 1 0)5Са(ЦО ) 0,4ВРО 4 1,0 0 4К НР 01 0,1Агар-агар 25,0ДрожжевойавтолизатСмесь микроэлементов поБуркгопьдеру 5,0 млНабор микроэлементов по Буркголь"деру включает следующие"компоненты(мг/л среды): К 1"0,1; В - 0,01;МФ+" 0,01; Еп+- 0,01; СРл - 0,01;Дрожжи выращивают на скошенномагаре в течение двух сут при 28"30 СОВодную суспензию клеток с агаризованной среды переносят в колбы объемом750 мп,содержащие 50 мл посевнойсреды следующего состава, г/л:н-гексадекан8,0(ИН) 50 , З,ОИд 50 7 Н О 0,7йаС 0,5Са(МО) 0,4КНРО 0,1Тиамин 500 мкгСмесьмикроэлементов 5,0 млВыращивание проводят 48 ч на качалке (260 об/мин) при 28-30 С. Полученный посевной материал вносятв количестве 2 л, в среду для Ферментации, которая осуществлялась такжев колбах обьемом 750 мл с 50 мл среды аналогичного состава,Через 24 ч от начала культивирования в колбы вносят итаконат натрияв различных концентрациях. рН средыподдеркивают 5,5-6,5 путем добавления 10 йаОН, В табл.1 приведенырезультаты, полученные после четырех сут культивирования.Из таблицы видно, что добавлениев среду итаконата приводит к изме"нению соотношения накапливаемых кис"лот в сторону иэолимонной кислоты( по сравнению с контролем) и темсамым повышает выход последней отиспользованного субстрата.П р и м е р 2. Дрожжи Сапд 1 да11 ро 1 ус 1 са ИБФИ Уподдерживаюти выращивают на питательной средетого же состава, как описано в примере 1,Через 24 ц культивирования вопытные колбы вносят оксалат натрияв различных концентрациях. В табл.2приведены результаты определения со5,0 мл 5 8497держания в культуральной жидкостилимонных кислот после. 96 ч культивирования.Полученные данные показывают, чтоиспользование оксалата также повышаетвыход изолиманной кислоты.П р и м е р 3 Дрожжи СапЬ 1 Ьа11 ро 1 уй 1 са. ИБМФ Уподдерживаютна агаризованной минеральной средеРидер, имеющей такой же состав,какв примере 1. В качестве источникауглерода использукн этанол (10,0 г/л).Культуру выращивают на скошенномагаре в течение трех сут при 28-30 С,Водную суспензию клеток с агаризован Зной среды переносят в колбы объемом750 мл, содержащие 50 мл посевнойсреды.Среда для получения посевного ма":териала имеет следущщий состав, г/л: 26(йн 4)5 О 4 0,3Мд 507 Н 2 О 0,7йаС 1 0,5Са (йО)0,4КН,РО 4 1 О . 25К 2 НРО 40Этанол 10,0Тиамин 500 мкгСмесь микроэлементов 5,0 мл ЗвВыращивание проводят 48 ч на качалке(260 об/мин)при 28-30 С, Полученную посевную .культуру переносятв новую партию колб со средой того же состава в количестве 5 Ф от объе"ма среды.1Через 24 ч от начала культивирования в колбы вносят итаконат натрия в концентрации 5 мМ. рн средыво время культивирования поддержи- щвали равным 5,5-6,5 введением раствора йаон.Через 5 сут культивирования всреде накапливается 7,2 г изолймонной кислоты и 2,0 г лимонной кислоты в 1 л. Выход изолимонной кислотысоставляет 723 от внесенного субстрата. В колбах без добавления итаконатаобнаруживается 6,4 г изолимонной и2,4 лимонной кислоты.П р и м е р 4. Дрожжи СапЬ 1 Ьа11 ро 1 ут.1 са И 6 ФМ У.выращивают наскошенном агаре,как в примере 1.Водную суспензию клеток с агаризован"Иной среды переносят в колбы объемом750 мл, содержащие 50 мл посевнойсреды следующего состава, г/л: 80 6Нормальные парафины(йН 4) 5 а 4 2,0мд 5 О. 7 н,о 0,7йаС 1 0,5Са (НО ) 0,4КН РО 1,0КНРО 4 . О 1Соль Мора .3,5 мгТиамин 5009 мкгСмесь микроэле-,ментов 5,0 мпЧерез 48 ч инкубации на качал"ке (260 об/мин ) полученную посевнуюкультуру переносят в новую партиюколб с посевной средой, объем ино-кулюма - 5 Ф от объема среды,500 мл выросшей культуры переносятв ферментационную среду ( 3,5 л ) сне" .дующего состава, г/л:Нормальные парафины, Смесь микроэлемен- тов Через 24 ч и 50 ч от начала куле тивирования в Ферментационную среду добавляют итаконат натрия в концентрации 5,0 г/л (конечная концентрация итаконата 10,0 г/л).Ферментацию проводят в ферментационном аппарате .при постоянном перемешивании и поддержании концентрации кислорода в среде 75-853 насыщения. рН среды поддерживают на уров" не 5,5-6,5 введением раствора йаОН,Через 144 ч культивирования в среде накапливается 67,0 г/л изоли-.", монной кислоты и 29,0 г/л лимонной кислоты. Кроме того определено 23,4 г/л неиспользованного парафина, Выход изолимонной кислоты от потреб" ленного субстрата составляет 1003. Соотношение лимонной и изолимоннойкислот - 1:2,3 При проведении ферментации на питательной среде, содержащей 72,0 г/л нормальных парафинов без добавления итаконата, накапливается 485 г изолимонной кислоты ( выход 67,33 отИтакойат натрия, мИ Измеряемыйпараметр Контроль Лимонная кислота, г/ло Изолимоннаякислота, г/л 6,0 6,4 62 68 50 5,0 Выход изолимоннойИзмеряем параметр тр в е е в Лимоннаякислота,г/л 4,4,0 3 3 Изол кисл монная а, г/,6 б 5,0 7 8субстрата ) и 54,0 лимонной кислоты.Соотношение кислот 1: 1,П р и м е р 5, Выращивание дрожжей на скошенном агаре, получениепосевного материала и ферментафион"ный процесс осуществляют, как в дрие,мере 2. ферментационная среда содержит нормальные парафины С - С вконцентрации 100,0 г/л.ю 9Через 24 ч и 50 ч культивированияв среду вносили соответственно .,2,0 г/л и 3,0 г/л итаконтата натрия(конечная концентрация итаконата5,0 г/л).После 144 ч культивирования вферментафионной среде обнаруживают68,3 г/л изолимонной кислоты и. 33,7 г/л. лимонной кислоты). Конфвнт"рация остаточного парафина в среде -;37,8 г/л. Выход изолимонной кислотыот использованного. субстрата Составляет 109,83. Соотношение лимоннойи изолимонной кислот равно 1:2. 49780 8Выход лимонных кислот и их соотношение при культивировании дрожжейна среде без добавления итаконатабыл таким же, как описано в приме" з ре 4.Внесение в ферментафионную средуитаконата или оксалата натрия вконцентрациях от 1,0 до 6,0 мМсдвигает соотношение экстретируемых 1 в дрожжами лимонных кислот в сторонупреимущественного накопления изолимонной кислоты, повышая, тем самым,ее конфеитрафию в ферментафионномрастворе, а зто, в свой очередь,при И водит к тому, что значительно облегечаются профессы выделения этой кислоты из раствора и последующей мимочистки, Использование данного способа позволит одновременно повысить 26 концентрацию изолимонной кислоты врастворе и ее выход, что приведетв снижению ее стоимости и расширениюобласти ее применения.Т а б л и ф а 1 1,7 1,75 1,75 1,5 1 8:2)1 1:1,9 рмула изобретения Составитель МЛаринаедактор Е.Зубистова Техред А. ЬабинецКорректор У.Пономаренк аказ 10784/7 Тираж 521 ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж, Раушская наб., двтент", г, Ужгород, ул. Проектная,1. Способ полуумения изолимонной кислоты путем культивирования дрожжей вида Сапд 1 па 11 ро 1 уй 1 са в условиях аэрации на питательной среде, содержащей источники углерода, азота, фосфора и минеральные соли, о т л ич а ю щ и й с я тем, что, с целью повышения выхода целевого продукта, в питательную среду в процессе культивирования вносят ингибитор иэоцит" рат-лиазы в концентрации.1,0"60,0 мй. ЗВ2. Способ по и. 1, о т л и ч а ющ и й с я тем, что в качестве инги-.1т битора используют итаконат натрияили оксалат натрия.3. Способ по и.1, о т л и ч а ю"щ и й с я тем, что в качестве источника углернда используют нормальные- парафины или этанол.Источники информации,принятые во внимание при,экспертизе1, Авторское свидетельство СССРН 30 У 87, кл. С 12 Э 1/04, 1968.2. Патент франции Н 1596056)кл. С 12 д опублик. 1970,3. Авторское свидетельство СССРпо заявке У 2844702/13,кл. С 12 Р 7/48, 1979.